淺談：從藥理&毒理&警示結(jié)構(gòu)，理解藥物的基因毒問題！

       近年來，基因毒問題是藥物開發(fā)、乃至上市后藥品質(zhì)量評價的重要內(nèi)容之一，甚至成為了行業(yè)內(nèi)的“閃點”、“燃點”！然而，大部分同行在聊及基因毒問題時，大都僅停留在警示結(jié)構(gòu)、1.5ug的概念，很少從藥理毒理的角度來思考基因毒的真正內(nèi)涵。故，整理此文，望共同進步。

       一、什么是遺傳毒？

       遺傳**可分為DNA損傷、基因突變、染色體結(jié)構(gòu)改變和染色體數(shù)目改變四類。廣義的遺傳**，是指由遺傳毒物引起生物細胞基因組分子結(jié)構(gòu)特異改變而使遺傳信息發(fā)生變化的有害效應(yīng)；因此，通過DNA損傷產(chǎn)生突變以及基因組復(fù)制過程誤差率增高皆為遺傳**的表現(xiàn)。而狹義的遺傳**是指遺傳毒物對DNA(或染色體)的損傷作用。

       二、遺傳毒理學(xué)歷史

       1927年，遺傳毒理學(xué)起源于H.J.Muller的開創(chuàng)性工作，他的研究發(fā)現(xiàn)放射不僅能夠增高突變的頻率，而且誘發(fā)的突變型或表型與沒有放射時所觀察的完全一致。所以，誘發(fā)的突變反應(yīng)必須根據(jù)基礎(chǔ)突變來評價。

        1938年，Sax在Muller研究的基礎(chǔ)上，又研究發(fā)現(xiàn)X射線能夠誘發(fā)紫露草花粉顆粒中染色體結(jié)構(gòu)畸變。在完全缺乏有關(guān)DNA結(jié)構(gòu)和染色體組成的情況下，Sax和他的同事發(fā)現(xiàn)染色體內(nèi)或染色體間的交換需要在核內(nèi)至少有兩處大的損傷。另外發(fā)現(xiàn)，接觸X射線總劑量不變，但延長接觸時間，或在幾小時內(nèi)分為兩部分接觸，產(chǎn)生染色體畸變的量降低。

       1946年，Auerbach和他的同事們報道了**能誘發(fā)果蠅突變，這些突變與X線誘發(fā)的突變表型是相同的，由此人們開始考慮化學(xué)物質(zhì)對遺傳的作用。

       到了20世紀(jì)70年代，有兩個事件使得能用誘變性資料來評價危險度。Miller和他的同事們研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)致癌物能在體外和體內(nèi)與DNA、RNA及蛋白質(zhì)作用形成穩(wěn)定的共價衍生物。

       同一時期，第二次發(fā)展改變了遺傳毒理學(xué)領(lǐng)域，那就是Ames（1975）和他的同事們所建立的用傷寒沙門菌進行一種簡單、廉價的突變試驗；該實驗可檢測化學(xué)物所致的組氨酸基因座的回復(fù)突變，并能結(jié)合使用一種外援性S9代謝系統(tǒng)。

       Ames試驗于今天已被廣泛使用，而進一步同為20世紀(jì)70年代的體內(nèi)微核試驗，經(jīng)過幾十年的發(fā)展和應(yīng)用，目前已出現(xiàn)使用圖像分析、流式細胞儀和激光掃描細胞儀等多種自動化系統(tǒng)檢測微核的方法。

       再之后，1994年Gatehouse等在Mutation Research上發(fā)表了國際遺傳**試驗標(biāo)準(zhǔn)化研討會上制定的開展Ames試驗的一系列建議；且OECD于1997年制定了Ames試驗的指導(dǎo)原則，又進一步促進了該方法的標(biāo)準(zhǔn)化和應(yīng)用。

       而今，ICH、OECD等機構(gòu)已制定并頒布多個指導(dǎo)原則，用于遺傳毒理學(xué)的研究，并在不斷的持續(xù)更新...

       三、我國國內(nèi)發(fā)布的指導(dǎo)原則

       我國于2007年10月23日發(fā)布了《藥物遺傳**研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。在該指導(dǎo)原則起草過程和審評過程中一直強調(diào)： 指導(dǎo)原則只是原則性指導(dǎo)，且僅能反映當(dāng)時的認識！ 研究者不能機械地照搬指導(dǎo)原則，而是應(yīng)充分發(fā)揮主觀能動性，積極跟蹤學(xué)科進展，推動研究工作。

       2018年3月，為指導(dǎo)和規(guī)范藥物遺傳**研究，國家食品藥品監(jiān)督管理總局組織修訂了《藥物遺傳**研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，且同時宣布原國家食品藥品監(jiān)督管理局2007年發(fā)布的《藥物遺傳**研究技術(shù)指導(dǎo)原則》廢止。

        我國最近發(fā)布的指導(dǎo)原則

        標(biāo)準(zhǔn)試驗組合

       指導(dǎo)原則指出：根據(jù)試驗檢測的遺傳終點，可將檢測方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據(jù)試驗系統(tǒng)，可分為體內(nèi)試驗和體外試驗。標(biāo)準(zhǔn)試驗組合應(yīng)反映不同遺傳終點，包括體內(nèi)和體外試驗，應(yīng)包含以下內(nèi)容：1）應(yīng)包含細菌回復(fù)突變試驗（又稱Ames試驗），該試驗已證明能檢出相關(guān)的遺傳學(xué)改變和大部分嚙齒類動物和人類的遺傳**致癌劑；2）應(yīng)包含哺乳動物細胞體外和/或體內(nèi)試驗。

       表1： 國內(nèi)指導(dǎo)原則標(biāo)準(zhǔn)試驗組合

       四、ICH頒布的指導(dǎo)原則

       1995年和1997年ICH分別頒布遺傳**指導(dǎo)原則S2A（藥物遺傳**試驗的特殊性指導(dǎo)原則）、S2B（遺傳**：藥物遺傳**試驗標(biāo)準(zhǔn)組合）；ICH遺傳**指導(dǎo)委員會于2006年6月啟動了遺傳**指導(dǎo)原則的修訂工作，并多次在美國、歐盟和日本等地召開會議商討修訂工作，最終于2011年11月正式修訂完成，完成ICH第四進程，推薦給ICH管理三方(歐盟、美國、日本)采納使用。

       標(biāo)準(zhǔn)試驗組合

       指導(dǎo)原則指出：選擇一具有更多的歷史應(yīng)用經(jīng)驗，部分原因是由于該組合被S2A和S2B指導(dǎo)原則推薦。然而，認為選擇一和選擇二同等適合的原因如下：當(dāng)體外哺乳動物細胞試驗結(jié)果為陽性時，兩個實施良好的體內(nèi)試驗（采用合適的組織和顯示有充分的暴露）的明確陰性結(jié)果，被認為足以證明缺乏體內(nèi)遺傳**潛在性，因此進行兩種體內(nèi)試驗的試驗策略，與對體外試驗陽性結(jié)果進行追加試驗是相同策略。

       表2：ICH S2（R1）指導(dǎo)原則標(biāo)準(zhǔn)試驗組合

       五、歷史上發(fā)生的藥品基因毒代表性事件

       2007年6月，羅氏制藥在歐洲市場推出的HIV蛋白酶抑制甲磺酸奈非那韋，因為在其產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)一種經(jīng)典的基因**雜質(zhì)~甲基磺酸乙酯超標(biāo)，EMA暫停了它在歐洲的所有市場銷售。甲磺酸乙酯的引入是由于在生產(chǎn)設(shè)備清洗時，乙醇未被完全烘干而殘留下來，與甲磺酸奈非那非原料藥中的甲基磺酸反應(yīng)形成甲基磺酸乙酯。

     羅氏在被要求徹底解決污染問題后，還需要補充**研究數(shù)據(jù)，以更好的評估甲磺酸奈非那非的基因毒雜質(zhì)對患者的風(fēng)險。直到羅氏公司完全解決了這些問題后，EMA才恢復(fù)了甲磺酸奈非那非在歐洲市場的相關(guān)授權(quán)。在這次甲磺酸奈非那非事件發(fā)生之后，世界各國的藥品管理機構(gòu)均針對基因**雜質(zhì)提出了更加明確的規(guī)定和要求，因此，國內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)在新藥的研發(fā)過程中也越來越重視基因毒雜質(zhì)的控制和檢測。

       六、小分子藥物中常見的基因毒（雜質(zhì)）問題

       那么，如何認識和控制基因毒雜質(zhì)呢？

       基因毒雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)多種多樣，對于絕大多數(shù)的雜質(zhì)而言，往往沒有充分的**或致癌研究數(shù)據(jù)，因而難以對其進行歸類。在缺乏安全性數(shù)據(jù)支持的情況下，大多數(shù)法規(guī)和指導(dǎo)原則采用“警示結(jié)構(gòu)”作為區(qū)分普通雜質(zhì)和基因**雜質(zhì)的標(biāo)志。對于含有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，應(yīng)當(dāng)進行（Q）SAR預(yù)測和體內(nèi)外遺傳**和致癌性研究，或者將雜質(zhì)水平控制在毒理學(xué)關(guān)注閾（TTC）之下。

       關(guān)于基因雜質(zhì)警示結(jié)果的具體詳細信息可參考歐盟發(fā)布的警示結(jié)構(gòu)《Development of structural alerts for the in vivo micro nucleus assay inrodents》，或進入The Carcinogenic Potency Database(CPDB)，里面有上千種致癌物質(zhì)的列表、結(jié)構(gòu)式、CAS號，作用部位，TTC值等一系列信息。

       ICH最早給出了的化學(xué)原料藥雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則Q3A（R2）、制劑雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則Q3B（R2），在這些指導(dǎo)原則中首次提到“對于能夠產(chǎn)生強的藥理活性或**的潛在雜質(zhì)，即使其含量低于0.1%，也必須進行進一步的結(jié)構(gòu)鑒定”。在之后修訂的版本中，進一步明確“要關(guān)注原料藥中的潛在遺傳**雜質(zhì)”，以及“對于**非常強的基因**雜質(zhì)，需要根據(jù)實際情況來制定更低的檢測限度”，但也并未針對遺傳**雜質(zhì)及其研究和控制問題提出明確的闡述，同時，對其研究原則、限度要求及控制策略均沒有具體的要求。

       EMEA人用藥品委員會(CHMP)推出《遺傳**雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》，引入了可接受風(fēng)險的攝入量，即毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）這個概念。設(shè)置了限度值TTC(1.5 μg/day)，即相當(dāng)于每人每天攝入1.5 μg的基因**雜質(zhì)，被認為對于大多數(shù)藥品來說是可以接受的風(fēng)險（一生中致癌的風(fēng)險小于十萬分之一）。根據(jù)此閾值，按照每日預(yù)期的攝入量去計算出該活性藥物中能夠接受的雜質(zhì)水平。值得注意的是，TTC只是一個概率的方法，具有一定的風(fēng)險。如果存在一個基因**雜質(zhì)，對其**未知，假設(shè)其每日的攝入量在TTC范圍內(nèi)，那它致癌的概率將會在10-5以下，因此限度值（TTC）不等于完全沒有風(fēng)險。PS：針對不同類型的藥物，也有不同的閾值及算法。

       表3： 藥品中的基因毒雜質(zhì)分類

       七、M7指導(dǎo)原則~非常重要！

       M7于2014年6月由 ICH 指導(dǎo)委員會在ICH進程的第4階段中予以通過；在ICH 進程的第4階段，最后的草案被推薦給歐盟、日本和美國的監(jiān)管機構(gòu)采納。

       M7旨在提供一個可用于致突變雜質(zhì)的鑒別、分類、界定和控制的可行性框架，以限制潛在的致癌風(fēng)險。同時，意在補充 ICH Q3A(R2)、Q3B(R2)和M3(R2)支持藥物進行臨床試驗和上市的非臨床安全性研究。PS：M7不適用于ICH S9范圍定義的用于晚期癌癥適應(yīng)癥的原料藥和制劑。

       M7再次給出了TTC、TD50、1.5μg/天等概念和數(shù)據(jù)，同時重點強調(diào)了上市后藥品變更后的基因毒雜質(zhì)問題；見下表。

       表4： 上市后藥品變更所要面對的基因毒雜質(zhì)問題

       八、結(jié)語

       基因毒問題，最為根本的還是安全性問題，而一個物質(zhì)是否安全、是否存在基因毒，要靠試驗和數(shù)據(jù)來證明。至今，我們已經(jīng)知曉了很多基因毒物質(zhì)、也知道了怎么判斷警示結(jié)構(gòu)，但依然出現(xiàn)了NDMA事件！且不論事出原因如何，結(jié)果都是藥品的質(zhì)量出問題了！不過，當(dāng)質(zhì)量出現(xiàn)問題之時，作為一個藥品從業(yè)人員，反思更多的應(yīng)該是問題出在了哪里？到底我們應(yīng)該如何做出“安全、有效、質(zhì)量可控”的藥物！