單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)用和發(fā)展現(xiàn)狀研究

       一

       背景概況

       單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是指能夠在單個(gè)細(xì)胞的水平上，對(duì)基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序分析的一項(xiàng)新技術(shù)。與傳統(tǒng)高通量測(cè)序相比，單細(xì)胞測(cè)序不僅能夠分析相同表型細(xì)胞的異質(zhì)性，還能獲取難以培養(yǎng)微生物的遺傳信息以及珍貴的臨床樣本的信息，具有廣闊的應(yīng)用前景。

       細(xì)胞是生命的單位，目前大部分的基因檢測(cè)均是從組織中抽提DNA 來(lái)進(jìn)行測(cè)序，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往是細(xì)胞群體中信號(hào)表達(dá)的均值，是對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行整體表征，或者只代表其中在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞信息，單個(gè)細(xì)胞獨(dú)有的細(xì)胞特性往往被忽略。

       而大量研究發(fā)現(xiàn)在同一器官或組織的相同類(lèi)型細(xì)胞也表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，每個(gè)細(xì)胞都有其獨(dú)特的表達(dá)模式。例如實(shí)體瘤樣本的總RNA，一半以上來(lái)源于非癌細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等），使得癌細(xì)胞的信號(hào)可能被隱藏。因此，采用均值對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行表征是不合適的，可能會(huì)丟失許多關(guān)鍵信息。

       另一方面，傳統(tǒng)高通量測(cè)序方法，難以應(yīng)用在對(duì)自然界中難培養(yǎng)的微生物的研究、罕見(jiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析、胚胎發(fā)生最早期的分化特征研究、腫瘤的非均質(zhì)性和微進(jìn)化研究等精確程度較高的研究領(lǐng)域[1]。隨著細(xì)胞分選和測(cè)序技術(shù)進(jìn)步，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

       （一）單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)頗受關(guān)注

       《Nature Methods》雜志將單細(xì)胞研究方法列為未來(lái)幾年最值得關(guān)注的技術(shù)領(lǐng)域之一?！禨cience》雜志將單細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首。

      2008—2018年P(guān)ubmed中單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)文獻(xiàn)數(shù)量變化

       數(shù)據(jù)來(lái)源：Pubmed，火石創(chuàng)造

       （二）單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)流程

       1. 單細(xì)胞分離

       針對(duì)單個(gè)細(xì)胞研究時(shí)，首先將單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離，并確保其生物完整性不被破壞。目前常用的單細(xì)胞分離方法有連續(xù)稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割術(shù)、拉曼鑷子技術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)和微流控技術(shù)等。

       2. 細(xì)胞溶解與基因組獲取

       對(duì)細(xì)胞進(jìn)行溶解來(lái)獲取基因組（DNA或RNA），這步驟非常關(guān)鍵，應(yīng)盡量保證基因組的完整性。目前細(xì)胞溶解的方法可以分為3大類(lèi): 物理法、化學(xué)法和生物酶降解法。

       3. 全基因組擴(kuò)增

       由于單個(gè)細(xì)胞中的基因含量無(wú)法達(dá)到測(cè)序儀的檢測(cè)線，因此需要對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，目前方法都是利用 DNA 聚合酶和不同形式的引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增的，包括特異性的、簡(jiǎn)并的或雜合的引物。

       4.測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

       對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)所得的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。

       二

       單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

       單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠快速確定成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的精確基因表達(dá)模式，分析相同表型細(xì)胞的遺傳信息異質(zhì)性。目前已應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)、器官生長(zhǎng)、癌癥生物學(xué)、臨床診斷、免疫學(xué)、微生物學(xué)、胚胎學(xué)、產(chǎn)前基因診斷等多個(gè)領(lǐng)域。

       1. 癌癥研究

       細(xì)胞異質(zhì)性是腫瘤的重要特征?；蛐彤愘|(zhì)性是指同一腫瘤內(nèi)部存在具有不同基因型的腫瘤細(xì)胞，而表型異質(zhì)性是指同一腫瘤內(nèi)部存在具有不同基因表達(dá)譜和功能特征的腫瘤細(xì)胞。

       眾多科研工作者基于單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)腫瘤異質(zhì)性進(jìn)行研究，鑒定癌變細(xì)胞及癌癥發(fā)展的過(guò)程。XU等[3]對(duì)腎腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)腎腫瘤細(xì)胞之間的突變頻率和位置不盡相同，每個(gè)細(xì)胞的突變狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄情況也均不相同，表明腎腫瘤更加具有異質(zhì)性，需要開(kāi)發(fā)更加有效的細(xì)胞靶向療法。

       2. 發(fā)育研究

       哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育階段的細(xì)胞數(shù)量極為稀少，其轉(zhuǎn)錄組分析尤其需要單細(xì)胞 RNA-Seq 技術(shù)。

       ZHONG等[4]給予2300個(gè)妊娠胚胎人腦前額葉細(xì)胞繪制出人腦前額葉胚胎發(fā)育轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)在發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)干細(xì)胞、興奮性神經(jīng)元細(xì)胞、抑制性神經(jīng)元細(xì)胞以及星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等六大類(lèi)細(xì)胞占主導(dǎo)地位，揭示了神經(jīng)元產(chǎn)生和環(huán)路形成的分子調(diào)控機(jī)制。

       組織器官發(fā)育是單細(xì)胞 RNA-Seq 技術(shù)應(yīng)用的另一個(gè)重要領(lǐng)域。近年來(lái)陸續(xù)報(bào)道了多種組織器官(包括肺、腦、腎、血液和內(nèi)耳)發(fā)育過(guò)程。

       3. 微生物研究

       由于微生物中的基因含量較低以及樣本稀少等原因，傳統(tǒng)的測(cè)序方法無(wú)法對(duì)難以培養(yǎng)的微生物進(jìn)行測(cè)序?；诰_程度較高，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠?qū)蝹€(gè)微生物細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的微生物，加深對(duì)微生物生命活動(dòng)過(guò)程的認(rèn)知。SUZANNE等[5]對(duì)某個(gè)稀有海洋微生物進(jìn)行了測(cè)序，通過(guò)分析表明該微生物與硫氧化有關(guān)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了參與有氧代謝有關(guān)的基因。

       三

       國(guó)內(nèi)外政府資金投入情況

       1. 國(guó)外政府投入情況

       目前，美國(guó)、歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)政府對(duì)單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域投入了大量資金，用于促進(jìn)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的優(yōu)化與各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用[6]。

       自2008年起，美國(guó)開(kāi)始資助單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)項(xiàng)目，之后一直呈現(xiàn)平穩(wěn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。自2014年起，關(guān)于單細(xì)胞測(cè)序的經(jīng)費(fèi)數(shù)及項(xiàng)目數(shù)量驟增，呈爆發(fā)性增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明美國(guó)近幾年對(duì)單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)項(xiàng)目的重視。共資助 915 個(gè)項(xiàng)目，累計(jì)經(jīng)費(fèi) 5. 39 億美元。

       另一方面，資助方向主要包括研究領(lǐng)域和應(yīng)用領(lǐng)域，可細(xì)分為分子和細(xì)胞基礎(chǔ)研究，感染性疾病、腫瘤、心血管與血液病和神經(jīng)**疾病研究，再生醫(yī)學(xué)與干細(xì)胞研究，生物多樣性研究，單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)工具、方法的建立，試劑與儀器設(shè)備的開(kāi)發(fā)，資源與平臺(tái)的建立等。

       2. 我國(guó)政府投入情況

       我國(guó)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)起步較晚，2010年，NSFC資助2個(gè)細(xì)胞測(cè)序相關(guān)研究項(xiàng)目，經(jīng)費(fèi)77萬(wàn)元。2013 年，隨著國(guó)際對(duì)單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域的熱度提升，NSFC 投入1500 萬(wàn)元用于相關(guān)研究，2014—2015 年資助項(xiàng)目數(shù)及資助金額雖然稍有回落，但2016 年又迅速增加至23項(xiàng)，超過(guò)2000 萬(wàn)元。

       研究領(lǐng)域主要包括單細(xì)胞測(cè)序儀器和技術(shù)開(kāi)發(fā)、腫瘤研究與監(jiān)測(cè)、胚胎發(fā)育、微生物基因組研究、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)、干細(xì)胞研究、神經(jīng)科學(xué)、在畜牧學(xué)、獸醫(yī)學(xué)中的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究、血液疾病等。

       3. 國(guó)內(nèi)外政府資金投入比較

       目前，我國(guó) NSFC、“863 計(jì)劃”和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃累計(jì)在單細(xì)胞測(cè)序領(lǐng)域資助經(jīng)費(fèi)約 1 億元，明顯低于美國(guó)不完全統(tǒng)計(jì)的 5.4 億美元，甚至英國(guó)的4千萬(wàn)英鎊。

      美國(guó)和中國(guó)對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的資金投入情況

       數(shù)據(jù)來(lái)源：參考文獻(xiàn)[6]

       四

       小結(jié)

       單細(xì)胞測(cè)序以單個(gè)細(xì)胞為單位，通過(guò)全基因組或轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠揭示單個(gè)細(xì)胞 的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)。

       單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在生物多樣性研究和細(xì)胞群體遺傳異質(zhì)性研究方面具有強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，將為生命科學(xué)研究人員提供全新的視角研究生命活動(dòng)。我國(guó)在單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)項(xiàng)目中的資助力度仍顯不足，隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的深度和廣度逐漸加強(qiáng)，仍需加大對(duì)該領(lǐng)域的資金支持，并充分利用現(xiàn)有資源推動(dòng)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步與應(yīng)用。

       參考文獻(xiàn)

       [1] 朱忠旭,陳新.單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015,34(5):902-908.

       [2] 董燕,宋程程,黃鶴.單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展[J].化學(xué)工業(yè)與工程,2015,32(1):71-78.

       [3] Xu X, Hou Y, Yin X, et al.Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation char-acteristics of a kidney tumor[J]. Cell, 2012, 148(5): 886-895.

       [4] Zhong S, Zhang S, Fan X,et al.A single-cell RNA-seq survey of the developmental landscape of the human prefrontal cortex [J].Nature,2018, 555(7697):524-528.

       [5] Suzanne D L, Bruer S L, Edgmont C A, et al .Ubiquitous dissolved inorganic carbon assimilation by marinebacteria in the Pacific Northwest coastal ocean as determined by stable isotopeprobing[J].PloS One,2012(7): e46695.

       [6]李?lèi)?ài)花,唐小利.美、英及我國(guó)政府對(duì)單細(xì)胞測(cè)序研究及應(yīng)用領(lǐng)域的基金資助[J].中華醫(yī)學(xué)圖書(shū)情報(bào)雜志,2017,26(9):44-51.

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