漫談PCR技術(shù)與抗體藥物：站在巨人肩膀上的PCR

       作為一個(gè)醫(yī)藥行業(yè)從業(yè)者，也許你對(duì)PCR再熟悉不過，但是，你可能無法清楚知道Kary Banks Mullis是哪位大神。

       引用自 NobelPrize.org

       因一項(xiàng)技術(shù)而非重大的理論發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng)，Kary Mullis的PCR技術(shù)應(yīng)該是第1個(gè)，估計(jì)也不會(huì)有第2個(gè)出現(xiàn)！

       PCR已經(jīng)成為醫(yī)藥行業(yè)中一個(gè)極為普遍的技術(shù)，深刻影響了生命科學(xué)的發(fā)展，雖然技術(shù)僅僅出現(xiàn)30年，但是PCR已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因測序、分子診斷、遺傳學(xué)等等！

       事實(shí)上，抗體藥物同樣與PCR技術(shù)息息相關(guān)，在抗體藥物的早期發(fā)現(xiàn)中扮演著重要的角色，筆者借此機(jī)會(huì)分享一些PCR在抗體藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。

       一．PCR是一個(gè)極為高效的DNA合成工廠

       雖然在抗體領(lǐng)域從業(yè)時(shí)間尚短，筆者對(duì)科學(xué)充滿著敬畏，深知一項(xiàng)改變世界的技術(shù)或是理論的價(jià)值，PCR在抗體藥物發(fā)現(xiàn)中的作用是十分關(guān)鍵的，與抗體的早期發(fā)現(xiàn)、基因工程、基因測序密切關(guān)聯(lián)！

       1. PCR與抗體發(fā)現(xiàn)

       從全球首個(gè)單抗藥物Muromonab上市以來，抗體藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)疾病領(lǐng)域，幾十年來，抗體的發(fā)現(xiàn)技術(shù)也逐步成熟，這其中雜交瘤技術(shù)、噬菌體展示文庫、酵母展示文庫已成為抗體藥物發(fā)現(xiàn)的主要技術(shù)方法。例如，利用雜交瘤技術(shù)發(fā)現(xiàn)的各種-ximab，-zumab，利用噬菌體展示文庫發(fā)現(xiàn)的阿達(dá)木單抗，利用酵母展示文庫發(fā)現(xiàn)的信迪利單抗。

       1.1 PCR與雜交瘤技術(shù)

       雜交瘤技術(shù)是一個(gè)極為經(jīng)典的抗體發(fā)現(xiàn)方式，當(dāng)然現(xiàn)在用于免疫的動(dòng)物已經(jīng)從小鼠擴(kuò)大到人源化小鼠、全人源小鼠、羊駝等。

       PCR在雜交瘤技術(shù)的用處主要在于免疫抗原的分子構(gòu)建，一般技術(shù)人員會(huì)讓基因合成公司合成特定抗原序列，然后，再將其構(gòu)建至in-house的表達(dá)載體。

       這是再熟悉不過的流程，但是，如果沒有PCR，你便會(huì)知道這是天方夜譚！

       1.2 PCR與抗體展示文庫

       抗體展示文庫也是抗體開發(fā)歷史上的一個(gè)巨大突破，這其中噬菌體展示文庫更是廣泛應(yīng)用于抗體發(fā)現(xiàn)，George P. Smith和Gregory P.Winter是該領(lǐng)域的先驅(qū)，而PCR主要用于抗體展示文庫的構(gòu)建。

       Human-naïve 或 immune 抗體展示文庫中，PCR扮演重要角色：

       A. 從動(dòng)物免疫細(xì)胞或是PBMC中提取tRNA，并利用PCR合成cDNA；

       B. 利用PCR擴(kuò)增抗體的Vh, Vk/λ；

       C. scFv的分子構(gòu)建。

       Schematic overview about the panning and screening procedure

       上圖參考來源為：《antibody engineering》

       阿達(dá)木單抗，全球首個(gè)全人員單克隆抗體，便是利用噬菌體展示文庫發(fā)現(xiàn)的。

       1.3 PCR與抗體人源化和親和力成熟

       上文提到，雜交瘤技術(shù)是抗體發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典方法，但是鼠源抗體免疫原性和親和力是一個(gè)很大的問題，為了降低免疫原性，降低ADA，同時(shí)提高親和力，很多利用雜交瘤技術(shù)發(fā)現(xiàn)的單抗都要經(jīng)過人源化(humanization)，以上事藥物中，凡是通用名-ximab，-zumab結(jié)尾的多是這種情況！

       圖片源自網(wǎng)絡(luò)https://www.biologicscorp.com/antibodyengineering.html/#.XVFVCG8zbOQ

       人源化和親和力成熟是一門大學(xué)問！無論是，CDR-grafting，定點(diǎn)突變或是抗體的定向進(jìn)化，PCR均是在這里充當(dāng)著基本的技術(shù)角色。

       2. PCR與抗體測序

       雜交瘤技術(shù)中，多輪亞克隆后，篩選到高親和力克隆，一定是需要對(duì)Vh, Vk/λ測序的，這個(gè)過程就是PCR的過程！

       total RNA→cDNA→Vh/Vk PCR→構(gòu)建至載體→測序

       3. PCR與雙特異性抗體

       雙特異性抗體不同于單克隆抗體，雙抗面臨許多工藝問題，盡量提高目標(biāo)雙抗的產(chǎn)量，同樣盡量降低非目標(biāo)雙抗的含量，這是雙抗的終極目的。

       但是，遠(yuǎn)非這么簡單，雙抗的format是多種多樣的，有的看起來還極富想象力，有的很美，有的很丑，充滿腦洞，各種各樣format的分子構(gòu)建都要依賴PCR技術(shù)，例如，安進(jìn)的BiTE, 羅氏的crossmab和knob-into-hole等等！

       PCR在抗體藥物中的應(yīng)用絕不止以上幾個(gè)方面，細(xì)胞株的傳代穩(wěn)定性、細(xì)胞株構(gòu)建、常規(guī)的分子構(gòu)建和蛋白表達(dá)等，各種的花式PCR技術(shù)，巢式PCR，多重PCR，qPCR，熒光PCR，real-time PCR等等，充滿著想象力！

       二．漫談Kary Mullis

       PCR改變了世界，Kary Mullis的PCR技術(shù)也是站在偉人的肩膀上的一項(xiàng)發(fā)明！筆者看來，PCR技術(shù)得以出現(xiàn)，它是建立在多個(gè)諾貝獎(jiǎng)級(jí)別的關(guān)鍵突破上：

       1. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的解析，Waston、Crick和Wilkins做出重要貢獻(xiàn)，諾貝爾獎(jiǎng)1；

       2. 1957年，Arthur Kornberg發(fā)現(xiàn)第一種DNA聚合酶，開始正確認(rèn)識(shí)DNA復(fù)制的分子過程，諾貝爾獎(jiǎng)2；

       3. H.Gobind Khorana破解了所有密碼子，開創(chuàng)了許多寡核苷酸的合成技術(shù)，諾貝爾獎(jiǎng)3；

       4. Khorana和他的學(xué)生Kleppe 發(fā)表一篇具有里程碑意義的文章Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases[1]，這被廣泛認(rèn)為是PCR雛形；

       5. 1976年，Jhon Trela和錢嘉韻成功從Thermus aquaticus內(nèi)提取到了能夠耐75℃以上高溫的TaqDNA聚合酶[2][3]，這是極為重要的一個(gè)進(jìn)展；

       6. 1987年，Kary Mullis關(guān)于PCR 的關(guān)鍵技術(shù)論文發(fā)表在Methods in Enzymology

       7. 1993年Kary Mullis獲諾貝爾獎(jiǎng)

       正是上面1，2，3，5的關(guān)鍵理論和技術(shù)突破給PCR的出現(xiàn)奠定了良好的基礎(chǔ)，Kary Mullis是一個(gè)被選中的天才。

       從其自傳中，我們能夠?qū)ary Mullis有一個(gè)較為淺顯的認(rèn)識(shí)，嚴(yán)重拖延癥、幻想癥、磕藥，筆者不對(duì)其三觀和行為持任何觀點(diǎn)，但是毫無疑問，他首先是一個(gè)天才，對(duì)，作為一個(gè)科學(xué)家，Kary Mullis科學(xué)知識(shí)扎實(shí)、思維活躍、極富想象力和洞察力，這是非常難得的科學(xué)品質(zhì)！

       參考來源：

       1. Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG "Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases." J. Molec. Biol. vol. 56, pp. 341-61 (1971).

       2. Brock TD, Freeze H "Thermus aquaticus, a Nonsporulating Extreme Thermophile" J. Bacteriol. vol. 98(1) pp. 289-297 (1969).

       3. Chien A, Edgar DB, Trela JM "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus" J. Bacteriol. vol. 174 pp. 1550-1557 (1976).

       4. Mullis KB and Faloona FA "Specific Synthesis of DNA in vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction." Methods in Enzymology vol. 155(F) pp. 335-50 (1987).

       附：the PCR song

       作者簡介：1°C，醫(yī)藥行業(yè)從業(yè)人員，希望自己的專業(yè)文字會(huì)越來越有溫度，醫(yī)藥知識(shí)能夠服務(wù)更多人，打破信息知識(shí)的壁壘！