CD47為慢病毒載體披上隱形衣或助肝靶向基因療法逃脫先天免疫

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來源：醫(yī)麥客

2019-05-27

在一些血友病基因療法中，腺相關(guān)病毒(AAV)作為載體來遞送表達(dá)功能凝血因子的基因。這種方法的一個局限性是，大多數(shù)人已經(jīng)對AAV產(chǎn)生了自然免疫，這可能使治療無效。

近日，由意大利米蘭San Raffaele Telethon基因治療研究所的科學(xué)家們領(lǐng)導(dǎo)的一個小組發(fā)現(xiàn)了一種可能的方法：通過欺騙免疫系統(tǒng)來改善血友病基因療法的遞送。

他們利用天然抑制劑CD47整合到慢病毒載體(LVs)的表面，抵消吞噬細(xì)胞對它們的捕獲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率更高，急性炎癥反應(yīng)的激活減少；在非人靈長類動物(NHPs)的實驗中，LVs能夠在不引起**的情況下將治療基因轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞——體內(nèi)凝血因子合成的主要場所。這項研究于5月22日發(fā)表在Science Translational Medicine雜志上。

遞送血友病基因療法，慢病毒載體具有潛力

針對遺傳性凝血障礙血友病的肝靶向基因治療是基因治療最成功的應(yīng)用之一。目前，重組凝血因子VIII或IX(FIX)蛋白替代治療(PRT)分別是A型血友病和B型血友病的標(biāo)準(zhǔn)治療。然而，基因治療可能會在一次給藥后建立一個穩(wěn)定的組織功能因子來源，從而避免終生頻繁靜脈注射PRT的要求，并有可能提供對該病的徹底治愈。

單次靜脈注射重組腺相關(guān)病毒(AAV)衍生載體，將凝血因子基因的功能副本運送至肝臟(凝血因子基因的天然生產(chǎn)部位)，已顯示出對血友病患者的安全性和有效性，并有望成為臨床可用的治療選擇。

然而，由于AAV載體不能主動整合到宿主細(xì)胞基因組中，并且抗AAV免疫反應(yīng)限制了載體的重新整合，這類基因治療可能難以應(yīng)用于兒童患者。此外，相當(dāng)一部分成年患者對AAV預(yù)先免疫；因此，他們由于具有中和的抗AAV抗體(Abs)而沒有資格接受AAV載體給藥，或者由于對AAV衣殼的細(xì)胞免疫，需要免疫抑制一段時間來維持AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞。

在I/II期研究中，基因療法先驅(qū)Spark Therapeutics的SPK-8011用于治療A型血友病，使得12名患者的年出血率和輸血需求均下降了97%。然而，值得注意的是，Spark試驗中劑量的2名患者(即進入III期試驗的劑量)出現(xiàn)了免疫反應(yīng)，導(dǎo)致他們的因子水平降至正常水平的5%以下。

和AAV一樣，慢病毒(LV)也被用于基因治療。Bluebird Bio的LentiGlobin，旨在治療另外的血液疾病 - β地中海貧血癥和嚴(yán)重的鐮狀細(xì)胞病，使用LV將人類β-珠蛋白基因的功能性版本插入患者的造血干細(xì)胞中。

LV由HIV衍生而來，它不像AAV那么流行，因此應(yīng)該是更好的基因治療遞送載體選擇。研究者認(rèn)為，隨著時間的推移，AAV療法的療效似乎在減弱，而這正是LV可能擁有的另一種優(yōu)勢。因為LVs能積極地整合到宿主細(xì)胞基因組中，并在細(xì)胞分裂時得以維持，如果不與插入突變的顯著風(fēng)險相關(guān)，這對于建立長期表達(dá)具有潛在優(yōu)勢。

CD47 - 別吃我信號

然而，意大利的研究人員注意到，在發(fā)揮治療作用之前，LV可以被肝和脾的吞噬細(xì)胞(吞噬外來分子的白細(xì)胞)清除。

眾所周知，CD47蛋白是一種抑制巨噬細(xì)胞吞噬的信號分子，信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRP-α)的特異性配體。

因此，圣拉斐爾Telethon基因治療研究所的科學(xué)主任Luigi Naldini和同事們假設(shè)，將CD47連接到LV可以幫助基因療法逃離巨噬細(xì)胞的“魔爪”。

整合CD47到慢病毒，逃避免疫從而提高效率

研究通過瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)CD47，構(gòu)建了先前報道中的LV穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系和293T細(xì)胞，用于LV生產(chǎn)。為此，研究人員用CD47表達(dá)的自失活γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(SIN RVs)轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞。

在293T細(xì)胞和LV生產(chǎn)細(xì)胞系(CD47hi細(xì)胞)的細(xì)胞表面上實現(xiàn)了CD47蛋白穩(wěn)定10至30倍的過表達(dá)。由CD47hi細(xì)胞產(chǎn)生的LV在對照293T細(xì)胞上具有與親本細(xì)胞產(chǎn)生的載體相當(dāng)?shù)牡味群透腥拘?，并且通過電子顯微鏡顯示CD47的免疫染色顯著增加(P<0.0001)。

LV表面上CD47的量不影響包膜蛋白- 水泡性口炎病毒蛋白G(VSV.G)的存在，與CD47hi LV的未改變的感染性一致。當(dāng)CD47hi和對照LV與巨噬細(xì)胞系或原代人巨噬細(xì)胞一起孵育時，發(fā)現(xiàn)CD47hi LV的攝取顯著降低(P=0.0303)，其達(dá)到對照293T細(xì)胞中觀察到的基礎(chǔ)水平。相反，人巨噬細(xì)胞對無CD47LV的攝取顯著高于對照LV(P=0.0083)。

這些數(shù)據(jù)表明，調(diào)節(jié)LV顆粒上CD47的量可以影響人巨噬細(xì)胞對它們的攝取。

在NOD小鼠的體內(nèi)研究中，CD47hi LV表現(xiàn)出對吞噬作用和先天免疫激活的易感性降低；活體成像顯示，CD47調(diào)節(jié)KCs(庫弗氏細(xì)胞)對LV吞噬作用的速率和程度。

NHPs是最接近人類的模型，和人類之間SIRP-α和CD47的序列同源性分別為94%和99%。因此，下一步研究選擇恒河猴作為受試者，因為與其他NHP物種相比，對HIV感染的限制較低。

他們證明，LVs向NHP的體內(nèi)施用(靜脈注射)是安全且耐受良好的，并且表明CD47hi LV對先天免疫系統(tǒng)的活化減少，并且進一步增加肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移。

盡管全基因組LV整合必然意味著對延遲的腫瘤發(fā)生的擔(dān)憂，但該研究結(jié)果顯示在NHP中沒有LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的肝細(xì)胞或肝腫瘤擴張的跡象，盡管存在治療個體數(shù)量和觀察時間的固有限制。NHP肝臟和脾臟中的LV IS分析顯示出不同的組成，幾乎所有獨特的IS由1-4個基因組代表，表明沒有發(fā)生克隆擴增，并且與處理的NHP中大多數(shù)肝細(xì)胞預(yù)期的低至無增殖率一致。

此外，迄今為止，在幾項臨床試驗中，LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的造血干細(xì)胞(HSCs)或T細(xì)胞治療的數(shù)百名患者中，沒有任何關(guān)于插入性腫瘤發(fā)生的證據(jù)，這包括對最早接受治療的患者隨訪10年以上。鑒于HSC對致癌轉(zhuǎn)化的敏感性可能高于肝細(xì)胞，這些發(fā)現(xiàn)令人放心，并支持LV設(shè)計、IS選擇和多克隆重建都有助于減輕這種風(fēng)險的說法。

研究小組補充說，整合CD47可以降低所需的LV劑量，從而緩解制造需求，并降低副作用的可能性。

參考出處：

https://www.fiercebiotech.com/research/improving-viral-vectors-for-hemophilia-gene-therapies-by-tricking-immune-system

https://stm.sciencemag.org/content/11/493/eaav7325

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