代謝產(chǎn)物安全性評(píng)價(jià)(MIST)的“十年之癢”

       眾所周知，藥物進(jìn)入機(jī)體后，能夠在各種酶的催化下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)變，生成結(jié)構(gòu)相近的代謝產(chǎn)物。雖然結(jié)構(gòu)與母藥類似，但是代謝產(chǎn)物絕對(duì)算是項(xiàng)目研發(fā)中出現(xiàn)的新化學(xué)成分。利用動(dòng)物和體外手段對(duì)候選化合物進(jìn)行毒理研究，通常更關(guān)注母藥特性，而非代謝產(chǎn)物。并且動(dòng)物種屬與人體可能存在差異，不能簡(jiǎn)單假設(shè)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物就與人體就相同，當(dāng)某種代謝產(chǎn)物在人體中的暴露量與動(dòng)物種屬不成比例(disproportional)時(shí)，就存在安全性風(fēng)險(xiǎn)。鑒于此，代謝產(chǎn)物安全性評(píng)價(jià)(MIST，Metabolites in Safety Testing)的概念被提出。

       自上世紀(jì)90年代初，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)取得了突破性發(fā)展，革新了藥物代謝領(lǐng)域的技術(shù)手段，在諸如血漿等復(fù)雜基質(zhì)中代謝產(chǎn)物的鑒定也變得相對(duì)容易。再加上**標(biāo)記的ADME(吸收、分布、代謝和排泄)研究能夠?qū)ρ獫{、尿液和糞便生成定量代謝產(chǎn)物譜圖，使得代謝產(chǎn)物研究成為藥物研發(fā)的重要組成部分。

       雖然一般藥物對(duì)開發(fā)團(tuán)隊(duì)來說都很清楚代謝產(chǎn)物可能有藥效活性或者**作用，需要予以考察，但是具體到項(xiàng)目，卻面臨以下問題：

       1.哪些代謝產(chǎn)物需要納入安全評(píng)價(jià)范圍？

       2.是否存在代謝物暴露量的閾值，來決定進(jìn)一步研究的必要性？

       3.代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)是否有必要獲得？

       這些都需要有相關(guān)可遵循的法規(guī)或指導(dǎo)原則。

       MIST指導(dǎo)原則的變遷

       2002年，飽受人體代謝產(chǎn)物安全性困擾的工業(yè)界率先“發(fā)難”，一群來自不同公司和組織的科學(xué)家共同發(fā)表了藥物代謝產(chǎn)物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的建議書(參考文章2)，文章提出在人體血漿中暴露量占比超過藥物相關(guān)物質(zhì)總量25%的代謝產(chǎn)物，必須在臨床前毒理種屬研究中得到覆蓋，這是首次關(guān)于MIST的闡述。

       2008年，F(xiàn)DA終于發(fā)布了MIST的指導(dǎo)原則，將代謝物的閾值調(diào)整為人體血漿中藥物原型的10%。

       2010年在綜合了更廣泛的意見后，ICH發(fā)布了指導(dǎo)意見，提出在人體血漿中暴露量占比超過藥物相關(guān)物質(zhì)總量10%的代謝產(chǎn)物，在開展大規(guī)模臨床試驗(yàn)前，有必要對(duì)其進(jìn)行非臨床安全性研究(ICH M3(R2)。FDA隨后跟進(jìn)，在2016年修改指導(dǎo)原則與ICH看齊。

       圖片整理自參考文章

       這些指導(dǎo)原則在藥物安全性研究方面的促進(jìn)作用毋庸置疑，但更重要的是它們提供了一個(gè)框架，讓藥物研發(fā)對(duì)代謝產(chǎn)物的研究有據(jù)可依。從臨床前到臨床，每個(gè)階段所要解決的藥物代謝問題不盡相同，可能因策略及靶點(diǎn)而不同。如腫瘤晚期、耐藥HIV(艾滋病病毒)、先天性酶缺乏癥等嚴(yán)重疾病的藥物開發(fā)，對(duì)代謝產(chǎn)物安全性研究有相應(yīng)簡(jiǎn)化措施。對(duì)常規(guī)項(xiàng)目，代謝產(chǎn)物典型策略可以分為三個(gè)階段來描述：

       第一階段 (Pre-IND)

       在此階段，藥物代謝研究主要針對(duì)體外(in vitro)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(in vivo)，如肝微粒體、肝細(xì)胞、肝S9，重組酶或者血漿等。利用這些體外模型來孵育代謝產(chǎn)物，結(jié)合保留時(shí)間和質(zhì)譜裂解規(guī)律來比較不同種屬和人類的代謝產(chǎn)物定性/定量的差異，據(jù)此選擇合適的種屬開展毒理研究。或是研究動(dòng)物給藥后的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，和體外研究相輔相成。動(dòng)物的體內(nèi)結(jié)果并不能直接轉(zhuǎn)化為對(duì)臨床的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，而是通過分析動(dòng)物的主要代謝產(chǎn)物，判斷代謝物譜是否能夠覆蓋人體結(jié)果，這對(duì)臨床的安全性研究至關(guān)重要。

       第二階段 (臨床I期)

       臨床I期多劑量遞增試驗(yàn)(MAD)的穩(wěn)態(tài)血漿樣本可以用于人體代謝產(chǎn)物研究，這通常也是首次得到藥物的人體代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)。LC-MS靈敏度雖然可以滿足微量代謝產(chǎn)物的分析，但是合成代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品工作量過大，可以根據(jù)紫外吸收數(shù)據(jù)計(jì)算代謝產(chǎn)物與母藥的相對(duì)豐度。

       對(duì)于指導(dǎo)原則中代謝產(chǎn)物超過藥物相關(guān)物質(zhì)總量的10%，如何判斷？如果將母藥和所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量加和，需要大量合成標(biāo)準(zhǔn)品，顯然不現(xiàn)實(shí)?？傮w來講在這個(gè)階段，還不需要準(zhǔn)確定量，只要對(duì)比NOAEL(無明顯損害作用劑量)下毒理種屬的代謝產(chǎn)物和臨床藥效劑量下血漿代謝產(chǎn)物的結(jié)果，判斷是否存在臨床前未覆蓋的代謝產(chǎn)物即可。常用方法有兩種，一種是用Hamilton Pooling法計(jì)算代謝產(chǎn)物的“暴露量倍數(shù)”；另一種是依靠同位素標(biāo)記試驗(yàn)，根據(jù)嚙齒類同位素標(biāo)記的物質(zhì)平衡結(jié)果，對(duì)比大鼠的同位素標(biāo)記代謝產(chǎn)物濃度得到因子，進(jìn)而換算人體代謝產(chǎn)物的濃度。

       確定了臨床前代謝產(chǎn)物的覆蓋情況，就可以決定是否需要合成代謝物，是否需要開展專門的體內(nèi)和毒理研究。但是很多研究團(tuán)隊(duì)選擇把這部分工作往后放一放，在完成人體同位素ADME研究后再做決定，更有將針對(duì)代謝產(chǎn)物的研究放在臨床概念驗(yàn)證(PoC)之后的，這也算是避免由于PoC失敗做太多“無用功”。

       圖片源自FDA網(wǎng)站

       第三階段 (臨床II期后，臨床III期前)

       因?yàn)閷?duì)主要代謝產(chǎn)物的研究必須在擴(kuò)大臨床前完成，所以在這個(gè)階段所有必要的代謝物研究都應(yīng)該結(jié)束了。包括代謝物定量、利用高分辨質(zhì)譜確定未知代謝產(chǎn)物、人體同位素標(biāo)記ADME研究(還可以用于確定哪些代謝物需要DDI評(píng)估)以獲得所有代謝物譜圖等。

       對(duì)MIST的一些思考

       從2008年FDA發(fā)布MIST指導(dǎo)原則至今已經(jīng)十余年了，這十年間，對(duì)代謝產(chǎn)物和代謝安全性的重視逐漸深入人心，制藥工業(yè)已經(jīng)適應(yīng)了MIST指南的要求，大量案例也為研發(fā)團(tuán)隊(duì)的代謝物研究計(jì)劃提供了很好的借鑒。但是也遇到了不少的問題，首先，很少有項(xiàng)目真的開展過對(duì)代謝物的毒理研究，也很難找到循環(huán)代謝物直接引起安全問題的案例。很多情況下，明明安全問題已經(jīng)指向代謝物，但最終又拿不出十足的證據(jù)。一方面這可能是由于代謝物和母藥的性質(zhì)很難區(qū)分，另一方面，對(duì)于一些活性中間代謝物，常規(guī)分析方法有時(shí)檢測(cè)不到，造成很大難度。藥物依帕列凈 (Empagliflozin) 給予大鼠后，觀察到明顯的由代謝物介導(dǎo)的**，但未發(fā)現(xiàn)活性代謝物和下游代謝物。

       其次，反應(yīng)性代謝物或下游產(chǎn)物(如谷胱甘肽或半胱氨酸結(jié)合物的代謝物)由于其分子量和親水性高，通常通過膽汁和/或尿液迅速排泄，因此很難根據(jù)MIST的要求比較不同種屬間反應(yīng)性代謝物的暴露量差異。另外，在一些特定項(xiàng)目中測(cè)定靶組織中代謝物可能更為重要，卻難以在人體開展。換句話說，隨著技術(shù)的發(fā)展，對(duì)代謝產(chǎn)物的研究要做到何種程度？MIST所做的一切是否真的影響了藥物安全性評(píng)價(jià)，這些都是未來我們需要去思考和解決的。

       指導(dǎo)原則只是提供了一個(gè)方向，對(duì)每個(gè)項(xiàng)目一定要case by case的去針對(duì)性設(shè)計(jì)研究方案，除了常規(guī)**，還應(yīng)關(guān)注代謝物潛在的DDI發(fā)生。吉非羅齊 (Gemfibrozil)的葡萄糖醛酸化代謝物對(duì)西立伐他汀(cerivastatin)的代謝清除抑制(主要由CYP2C8和OATP1B1介導(dǎo))導(dǎo)致了嚴(yán)重的后果。此外還有丁苯丙酮的代謝物對(duì)CYP2D6表達(dá)水平的影響，以及去甲基地爾硫卓對(duì)CYP3A4的抑制作用等。FDA和EMA的指導(dǎo)原則分別建議，當(dāng)代謝物的體內(nèi)水平達(dá)到母藥的25%(FDA, 2012)，或暴露量超過藥物總暴露量的10%時(shí)(EMA, 2012)，需要對(duì)代謝產(chǎn)物的CYP抑制和轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制開展研究。FDA在2017年新的相關(guān)指導(dǎo)原則征求意見稿中進(jìn)一步要求，對(duì)警示性化學(xué)結(jié)構(gòu)(官能團(tuán))，需要開展TDI(時(shí)間依賴性抑制)研究；對(duì)極性小于母藥且暴露量超過母藥25%的代謝產(chǎn)物，以及極性大于母藥且暴露量高于母藥的代謝產(chǎn)物，需要開展代謝物體外DDI研究。

       總之，MIST指導(dǎo)原則的提出不僅僅是DMPK科學(xué)家的研究參考，很大程度上也讓藥化、藥理等科學(xué)家對(duì)代謝產(chǎn)物的安全性問題給予足夠的重視，只有這樣，新藥的安全評(píng)價(jià)才會(huì)更加徹底，這也是MIST對(duì)藥物研發(fā)的貢獻(xiàn)。

       參考文章：

       [1] A Decade in the MIST: Learnings from Investigations of Drug Metabolites in Drug Development under the “Metabolites in Safety Testing” Regulatory Guidance. DOI: https://doi.org/10.1124/dmd.117.079848

       [2] Drug Metabolites in Safety Testing. DOI:10.1006/taap.2002.9440

       [3] Metabolites in safety testing. https://doi.org/10.4155/bio.09.98

       [4] FDA-Safety Testing of Drug Metabolites Guidance for Industry.

       [5] Guidance for Industry M3(R2) Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals.

       [6] Metabolites in Safety Testing: “MIST” for the Clinical Pharmacologist. doi:10.1038/clpt.2009.283

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