張鋒團(tuán)隊(duì)帶來第三款CRISPR基因組編輯系統(tǒng) 顯著減少脫靶效應(yīng)

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來源：學(xué)術(shù)經(jīng)緯

2019-01-23

今日，CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的先驅(qū)之一張鋒教授在《自然》子刊《Nature Communications》發(fā)布一項(xiàng)重要進(jìn)展，報(bào)告了第三個(gè)可以編輯人類細(xì)胞基因組的CRISPR-Cas系統(tǒng)：CRISPR-Cas12b。

多功能基因組編輯系統(tǒng)CRISPR-Cas的問世，掀起了一場生物技術(shù)革命。在科學(xué)研究和醫(yī)療研發(fā)方面，這套基因編輯工具得到廣泛應(yīng)用，以此為基礎(chǔ)的基因編輯療法也展開臨床試驗(yàn)，在治療人類遺傳病方面初現(xiàn)潛力。

這一系統(tǒng)中的“元老”成員就是我們已經(jīng)熟悉的Cas9。不過Cas9也并非沒有限制，比如切割非靶點(diǎn)序列的脫靶效應(yīng)就是一個(gè)問題。鑒于CRSPR-Cas系統(tǒng)在微生物中廣泛存在，科學(xué)家們將Cas蛋白的類型范圍不斷擴(kuò)大，尋找新秀，例如Cas12a。

在與Cas9、Cas12a同屬2類CRISPR系統(tǒng)的Cas蛋白中，還有一個(gè)富有潛力的成員，就是Cas12b（過去被稱為C2c1）。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，因此更容易通過病毒載體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間遞送。

雖然有這樣的優(yōu)勢，Cas12b的開發(fā)卻遇到了一個(gè)阻礙。性能的Cas12b來自一種嗜酸耐熱菌（Alicyclobacillus acidoterrestris），但它作為DNA裂解酶的活性需要高達(dá)48℃。也就是說，如果放進(jìn)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，達(dá)不到這種Cas12b的溫度要求，酶活性就不能發(fā)揮。怎么“解鎖”這種Cas蛋白呢？

為了適用于人類基因組編輯，張鋒教授和同事們首先在Cas12b蛋白家族中尋找喜歡常溫的成員。最終，根據(jù)同源序列比對，他們從一種叫作外村尚芽孢桿菌（Bacillus hisashii）的細(xì)菌中鑒定出了在人體體溫（37℃時(shí)）能保持核酸酶活性的BhCas12b。并且，研究人員還通過調(diào)整指導(dǎo)RNA（sgRNA）的結(jié)構(gòu)，讓Cas12b的效率得到大幅提升。

可是，新的問題來了。體外切割實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原始結(jié)構(gòu)的Cas12b在DNA雙鏈斷裂時(shí)會切割非靶標(biāo)單鏈，并且溫度越低，這種錯(cuò)誤發(fā)生得越多。為了解決這個(gè)問題，研究者對Cas12b進(jìn)行了工程改造。根據(jù)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的線索，研究人員通過4個(gè)點(diǎn)突變，得到了重新設(shè)計(jì)的新Cas12b，讓酶的活性位點(diǎn)更容易和DNA靶序列接近。

經(jīng)過重新設(shè)計(jì)的Cas12b，基因組編輯的潛能如何呢？在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，研究人員針對多個(gè)基因的多個(gè)靶序列考察了Cas12b的編輯效率。對隨機(jī)引入插入缺失的分析結(jié)果顯示，新的Cas12b的編輯效率與Cas9和Cas12a相當(dāng)、甚至更高，足以在人體細(xì)胞中作為可編程的基因組編輯工具。

除了有效性，特異性對于一款強(qiáng)大的基因組編輯工具來說也非常重要。這一點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)也在人類細(xì)胞中利用GUIDE-seq技術(shù)對全基因組范圍內(nèi)的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，相比常用的Cas9，Cas12b導(dǎo)致的錯(cuò)誤插入缺失都要少得多，脫靶性顯著降低。

研究團(tuán)隊(duì)相信，在繼Cas9和Cas12a之后，改造的Cas12b將以其分子量小和靶向特異性高的兩大特點(diǎn)，成為又一款在體編輯人類基因組的有力工具。并且，這一顯著提升Cas12b效率的改造工程也為解鎖更多CRISPR工具提供了富有啟發(fā)的指導(dǎo)。

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