一文讀懂腫瘤免疫治療新貴——CAR-T

       免疫療法是當(dāng)下腫瘤治療領(lǐng)域前景的發(fā)展方向之一。隨著PD-(L)1等免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，CAR-T療法研究不斷出現(xiàn)新的進(jìn)展，CAR-T療法作為有別于傳統(tǒng)藥物的“活藥”，不僅對(duì)復(fù)發(fā)、難治性腫瘤患者表現(xiàn)出了突破性療效，其生產(chǎn)體系和使用場(chǎng)景也有別于普通藥物。鑒于當(dāng)下生物技術(shù)的更新速度，預(yù)計(jì)CAR-T療法還將帶給市場(chǎng)更多驚喜。本報(bào)告擬從CAR-T療法技術(shù)基礎(chǔ)入手，分析CAR-T療法的局限性及研發(fā)方向、行業(yè)發(fā)展情況、研發(fā)情況與如何選擇國(guó)內(nèi)標(biāo)的、投融資情況及行業(yè)總結(jié)。

       一、CAR-T療法是什么

       CAR-T（Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受體T細(xì)胞）療法，是指通過(guò)基因修飾技術(shù)，將帶有特異性抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域及T細(xì)胞激活信號(hào)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入T細(xì)胞，使T細(xì)胞直接與腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原相結(jié)合而被激活，通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶素B等直接殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還通過(guò)釋放細(xì)胞因子募集人體內(nèi)源性免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的目的，而且還可形成免疫記憶T細(xì)胞，從而獲得特異性的抗腫瘤長(zhǎng)效機(jī)制。

       CAR療法最早由Gross等于上世紀(jì)80年末提出，此前LAK、TIL、CIK等免疫細(xì)胞療法的出現(xiàn)，為CAR-T療法的研究奠定了基礎(chǔ)。至今除CAR-T療法外，DC-CIK、CTL等也是免疫細(xì)胞療法的研究方向，但從技術(shù)成熟度和應(yīng)用前景來(lái)看，目前學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注焦點(diǎn)仍是CAR-T療法。CAR-T療法在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有著顯著的療效，在體外和臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的靶向性、殺傷性和持久性，展示了巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。一個(gè)典型的CAR-T治療流程，主要分為以下五個(gè)步驟：

       I.分離：從癌癥患者外周血中分離純化出自身T細(xì)胞；

       II.修飾：T細(xì)胞激活后，利用基因工程將能特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入T細(xì)胞；

       III.擴(kuò)增：體外培養(yǎng)，大量擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞至治療所需劑量，一般為十億至百億級(jí)別（根據(jù)患者體重和治療周期決定）；

       IV.回輸：化療清淋預(yù)處理然后回輸CAR-T細(xì)胞至患者體內(nèi)；

       V.監(jiān)控：觀察療效并嚴(yán)密監(jiān)測(cè)不良反應(yīng)。

       整個(gè)療程持續(xù)3個(gè)星期左右，其中細(xì)胞“分離-修飾-擴(kuò)增”約需要2個(gè)星期，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。

       二、CAR-T的結(jié)構(gòu)

       CAR通常由一個(gè)胞外抗原結(jié)合域（如識(shí)別CD19的單鏈抗體序列scFv），一個(gè)鉸鏈區(qū)（促進(jìn)抗原受體與腫瘤抗原的結(jié)合），一個(gè)跨膜區(qū)（用來(lái)固定CAR），一個(gè)T細(xì)胞激活結(jié)構(gòu)域（CD3 ζ，提供T細(xì)胞活化的第一信號(hào)）以及一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域組成（CD28/4-1BB，提供T細(xì)胞活化的第二信號(hào)）。CAR的胞外抗原結(jié)合域源于抗體的抗原結(jié)合基序，可以連接VH和VL序列構(gòu)建的單鏈可變區(qū)（single chain fragment variable, scFv），具有特異性識(shí)別某種特定腫瘤相關(guān)抗原的作用。CAR識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，隨后通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域活化T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞進(jìn)行增殖，并發(fā)揮免疫效應(yīng)，釋放細(xì)胞因子，溶解腫瘤細(xì)胞。

       歷經(jīng)十余年，CAR-T經(jīng)歷了四代結(jié)構(gòu)，每一代結(jié)構(gòu)都是在各個(gè)細(xì)節(jié)上突破，使CAR-T往更為精準(zhǔn)、更為高效、更為持久的方向發(fā)展。T細(xì)胞的完全激活一方面依賴于胞外抗原結(jié)合域與抗原的結(jié)合所傳遞的第一信號(hào)，另一方面也需要共刺激分子受體與其配體結(jié)合所傳遞的第二信號(hào)，而腫瘤細(xì)胞表面通常不表達(dá)這類共刺激配體。第一代CAR設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，且并未考慮到這一點(diǎn)，從而致使一代CAR-T細(xì)胞缺少必要的共刺激信號(hào)，無(wú)法完全激活其活性，表現(xiàn)為體內(nèi)擴(kuò)增不良，在臨床試驗(yàn)中的效果并不理想。在第一代的基礎(chǔ)上，第二代CAR引入一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域CD28或者4-1BB，在臨床試驗(yàn)中顯著改善了CAR-T免疫活性激活的問(wèn)題，并提高了其作用持久性。

       第三代CAR則包含兩個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為CD28或4-1BB，另一個(gè)為OX40、CD28或4-1BB。相比于二代CAR而已，三代CAR雖然在一些前臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出更強(qiáng)更持久的作用活性，但也有報(bào)道指出，三代CAR可能會(huì)造成T細(xì)胞刺激閾值的降低，引起信號(hào)泄露，可能誘發(fā)細(xì)胞因子過(guò)量釋放。2013年5月，美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院發(fā)起了一項(xiàng)針對(duì)比較二代CD19 CAR-T（CD28）和三代CD19 CAR-T（CD28/4-1BB）在非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病和慢性淋巴細(xì)胞白血病中的治療效果的臨床試驗(yàn)，目前仍處于招募病人的階段（NCT01853631）。

       由于腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性，一部分腫瘤細(xì)胞不具有可被T細(xì)胞特異性識(shí)別的抗原，無(wú)法被傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞識(shí)別并清除。這一問(wèn)題或可通過(guò)四代CAR-T技術(shù)，募集除T細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞至腫瘤所在區(qū)域來(lái)解決。四代CAR-T細(xì)胞又被稱為TRUCK T細(xì)胞 ( T-cells redirected for universal cytokine killing )，含有一個(gè)活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of the activated T cell, NFAT）轉(zhuǎn)錄相應(yīng)元件，可以使CAR-T細(xì)胞在腫瘤區(qū)域分泌特定的細(xì)胞因子（目前主要是IL-12），從而修飾腫瘤微環(huán)境，募集并活化其他免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫反應(yīng)。目前，四代CAR-T療法已經(jīng)在包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的實(shí)體瘤治療的臨床試驗(yàn)中開展。

       第二代CAR-T有較多的臨床數(shù)據(jù)支持，穩(wěn)定性高且技術(shù)工藝較為成熟，是目前的主流技術(shù)。未來(lái)，隨著新結(jié)構(gòu)在臨床上的試驗(yàn)推廣及生產(chǎn)工藝的改進(jìn)，第三代、第四代CAR-T產(chǎn)品更為優(yōu)良的療效值得期待。

       T細(xì)胞受體（TCR）和四代CAR-T的結(jié)構(gòu)T細(xì)胞抗原受體

       （TCR是T細(xì)胞特異性識(shí)別和結(jié)合抗原肽-MHC分子的分子結(jié)構(gòu)，通常與CD3分子呈復(fù)合物形式存在于T細(xì)胞表面。大多數(shù)TCR由α和β肽鏈組成，少數(shù)T細(xì)胞的TCR由γ和δ肽鏈組成。ZAP70分子量為70kDa，是TCR的一部分。）

       三、CAR-T的優(yōu)勢(shì)

       無(wú)MHC限制性：CAR結(jié)構(gòu)使T細(xì)胞越過(guò)MHC提呈機(jī)制直接識(shí)別腫瘤細(xì)胞，同時(shí)獲得共刺激信號(hào)，被“一鍵激活”；這是CAR-T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)抗原抗體結(jié)合機(jī)制特異性識(shí)別腫瘤抗原，避免了腫瘤細(xì)胞通過(guò)MHC下調(diào)的逃逸機(jī)制；

       可識(shí)別的抗原種類多：MHC只能提呈蛋白質(zhì)片段（多肽），而CAR的抗原抗體機(jī)制可以識(shí)別細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)、多糖以及脂類蛋白，應(yīng)用較為廣泛。

       體內(nèi)繼續(xù)增殖“活的藥物”：CAR-T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)后將有效識(shí)別腫瘤細(xì)胞，被激活并繼續(xù)增殖，形成持續(xù)的殺傷力，而且還將通過(guò)釋放細(xì)胞因子等方式召集數(shù)量更多、種類更全的免疫細(xì)胞來(lái)協(xié)同作戰(zhàn)。這些性質(zhì)使得CAR-T療法與傳統(tǒng)的藥物、單抗以及小分子靶向藥物等血藥濃度會(huì)隨時(shí)間下降的治療方式比起來(lái)，具有更大的優(yōu)勢(shì)?？梢哉f(shuō)CAR-T是一種利用人體自身免疫細(xì)胞而制成的“活的藥物”。