Nature：從頭合成細胞

       僅靠八個元件、兩個蛋白質(zhì)、三個緩沖元件和兩個脂肪分子，再加上一些化學(xué)能量，就足以形成一串“活潑好動的”基礎(chǔ)細胞樣結(jié)構(gòu)，而且還可以自我分裂。

       這就是生物物理學(xué)家Petra Schwille創(chuàng)造出來的奇跡，這些會“跳舞”的小精靈是我們從頭開始合成細胞的第一步。為此，Schwille在德國馬克普朗克生物化學(xué)研究所（Max Planck Institute of Biochemistry in Martinsried, Germany）付出了十年的努力。

       Schwille一直在思考生命和非生命的區(qū)別。對她來說，的難點就在于判斷哪些組份才是構(gòu)成生命體的必要元素。在Schwille的人工合成細胞里，她知道每一個因素的作用。

       二十多年來，科研人員一直努力地創(chuàng)造人造細胞，他們的方法就是將各種生物分子按照某種方式組合起來。雖然有各種各樣不同的方法，但是大致可以分為以下三大類，分別是想辦法將生物分子包裹在某一個空間內(nèi)；或者研究足以維持生命的生物化學(xué)系統(tǒng)；或者研究細胞行為的信息控制、儲存和管理問題。

       得益于近年來微流體技術(shù)的進步，科研人員可以精細調(diào)控細胞組分之間的微小活動，所以人工合成細胞這方面的工作也在加速開展之中。目前科研人員已經(jīng)找到了一些方法，可以將細胞樣的小泡塑造成我們需要的樣子，也創(chuàng)造出了一些最基本的細胞代謝能力，而且還成功地將人造基因組轉(zhuǎn)移到活體細胞里。但是要想將所有成分全部組裝到一塊，挑戰(zhàn)還是很大的。

       但是科研人員還是充滿了信心。2017年9月，荷蘭17家實驗室的科研人員一起組成了“構(gòu)建人造細胞組織（Building a Synthetic Cell, BaSyC）”。據(jù)該組織的負責(zé)人兼荷蘭德爾夫特理工大學(xué)（Delft University of Technology）的生物物理學(xué)家Marileen Dogterom介紹，他們的目標(biāo)是在十年之內(nèi)，人工合成出一個細胞樣的、可生長和可分裂的新東西。目前，他們已經(jīng)得到了1880萬歐元（約合2130萬美元）的荷蘭引力基金（Dutch Gravitation grant）的支持。

       今年9月，美國國家科學(xué)基金會（US National Science Foundation, NSF）宣布了他們的第一個人工合成細胞項目，并表示將為此投入大約1000萬美元。包括Schwille在內(nèi)的多個歐洲的研究人員也都建議擁有10億歐元資金的歐盟委員會未來新興技術(shù)項目（European Commission’s Future and Emerging Technologies Flagship）對人工合成細胞給予經(jīng)費支持。

       從頭開始的合成生物學(xué)家都預(yù)計第一批具有真正意義的人工合成細胞將在大約十年之后誕生。Schwille就對此充滿了信心。

       全都在一起

       科研人員已經(jīng)在人工合成細胞的多個方面取得了不錯的進展，尤其在模擬生物膜方面成果突出。這主要是因為組織分子的關(guān)鍵就在于如何讓它們在合適的時間和地點發(fā)揮作用。雖然我們可以將十億個細菌打碎，將細菌裂解物全都倒在一支試管里，但是這些細菌在試管里的生物學(xué)反應(yīng)卻不能維持很久。我們必須將其中的某些成分分離出來，同時也必須讓其中的某些成分混在一起。

       德爾夫特理工大學(xué)的另外一位生物物理學(xué)家Cees Dekker表示，對他來說，這就是一個分子組成的社會。

       最開始，這意味著將生物分子在生物膜上，或膜結(jié)構(gòu)內(nèi)排列起來。Schwille及其課題組成員就是這方面的專家。大約在十年前，他們開始嘗試添加Min蛋白。這種蛋白可以指導(dǎo)細菌分裂，并可以將人造脂質(zhì)膜分裂成一片一片。后來他們又發(fā)現(xiàn)，Min蛋白可以讓生物膜彈起來，形成波動（wave）和旋動（swirl）。但是將Min蛋白加入3D立體的球狀生物膜結(jié)構(gòu)中時，生物膜球會破裂。于是Schwille等人嘗試使用微流體技術(shù)來解決這個問題，從而構(gòu)建出了細胞大小的生物膜結(jié)構(gòu)——脂質(zhì)小體（liposome）。這種脂質(zhì)小體解決了蛋白質(zhì)加入的問題，我們可以在其中，或者表面插入各種蛋白質(zhì)。

       Schwille的學(xué)生Thomas Litschel等人將Min蛋白溶于水，然后將這些蛋白溶液放入試管，

       并在振蕩器上快速振蕩，隨后這些溶液形成了蛋白小液滴。緊接著再將它們與濃稠的脂質(zhì)液體混合，離心，就能夠形成包裹了Min蛋白的脂質(zhì)小體。這種脂質(zhì)小體大約有10~20微米大小，剛好就是植物和動物細胞的水平。這些脂質(zhì)體也被稱作巨大單層囊泡（giant unilamellar vesicles, GUV）。雖然很多方式都可以制備這種物質(zhì)，但是Litschel等人的GUV因為有了Min蛋白，所以可以震動、收縮，并且四處游動。

       Schwille等人希望利用他們對這些Min蛋白質(zhì)的研究成果來吸引資金。她表示，她們真的理解這些分子，也非常想知道這些蛋白質(zhì)能夠做出什么。也許可以像Litschel等人那樣，利用這些Min蛋白來指導(dǎo)生物膜分裂，或者聚集成一個個小的細胞器樣的結(jié)構(gòu)等。很多物理學(xué)家會使用膠帶和錫箔來做實驗，Schwille覺得她們手上的那些蛋白也可以起到類似的作用。Schwille認為自己天生就是一個專門做實驗的材料。

       脂質(zhì)小體制造技術(shù)

       科研人員利用微流體技術(shù)來生產(chǎn)脂質(zhì)小體。這些脂質(zhì)小體與細胞膜結(jié)構(gòu)非常類似。其中有一種技術(shù)會用到6條微流體，使它們匯集到一處，如上圖所示。在1-辛醇的環(huán)境中，脂質(zhì)雙分子層會被包裹在內(nèi)部。經(jīng)過幾分鐘之后，這些1-辛醇會脫落，剩下完整的脂質(zhì)小體。

       Dekker的團隊成員還利用上圖所示的微流體芯片往脂質(zhì)小體里塞進了各種蛋白質(zhì)。在這種微流體芯片里，有兩個通道充滿了脂質(zhì)分子，還有一個通道里充滿了水分子，最終產(chǎn)生的細胞大小的脂質(zhì)小體里就可以裝入各種生物分子了，也可以保持膜的狀態(tài)，在容器里自由地漂浮。

       Dekker的團隊還對這些脂質(zhì)小體進行了加壓、變形和重塑等各種實驗，最終獲得了非球形的脂質(zhì)小體，以便可以更好地模擬細胞的形態(tài)。有了微流體設(shè)備，科研人員可以更好地控制脂質(zhì)小體的移動、分選和操控。Dekker等人今年還設(shè)計了一款芯片，能夠人工使一個脂質(zhì)小體一分為二，具體方法就是用外力將脂質(zhì)小體擠成兩半。當(dāng)然這不是Dekker等人追求的最終目標(biāo)，他們的目標(biāo)是希望脂質(zhì)小體可以由內(nèi)而外地自發(fā)分裂。但這個實驗也給我們提供了很多有意思的信息。比如，在分裂脂質(zhì)小體時，脂質(zhì)小體可以承受多大的力量和承受哪種力量等。Dekker團隊還對活體大腸桿菌的形狀進行了研究，他們用硅樹脂納米纖維材料制作了一種模子，從而讓大腸桿菌變得更方、或者直徑更大。他們通過這種途徑來研究細胞的形狀對細胞的分裂有何影響，同時了解Min蛋白在不同形狀和不同大小細胞里的作用。

       Dekker打趣道，他們使用納米技術(shù)做了其他正常細胞生物學(xué)家絕對不會做的實驗。但是像他這樣不正常的生物物理學(xué)家都會這么干。

       再加點能量進去

       現(xiàn)在，我們已經(jīng)可以往脂質(zhì)小體里加點東西了，科研人員需要思考的問題是如何讓這些細胞組份正常地運作起來。幾乎所有的生命體細胞都需要能量，最常見的形式就是ATP。雖然我們也可以往人造細胞里添加ATP，但是很多從事從頭合成工作的生物學(xué)家還是堅持，真正的細胞應(yīng)該有自己的能量供給來源，類似于動物細胞的線粒體（mitochondrion）和植物細胞的葉綠體（chloroplast）。

       德國海德堡馬克斯普朗克醫(yī)學(xué)研究所（Max Planck Institute for Medical Research in Heidelberg, Germany）的Joachim Spatz等人就構(gòu)建了一個人造線粒體概念機，可以自發(fā)產(chǎn)生能量物質(zhì)ATP。

       他們也在其中利用了最新型的微流體技術(shù)。首先，Spatz等人將GUV置于水油混合液滴（water-in-oil droplets）里，使其能夠穩(wěn)定存在，這些水油混合液滴則處于一個由多聚體物質(zhì)構(gòu)成的黏性環(huán)境（即多聚體外殼）中。當(dāng)這些水油混合液滴沉到底部的毛細通道之后，科研人員就會往其中注入大型蛋白質(zhì)分子，這些蛋白質(zhì)會進入GUV，或者固定在GUV的表面。

       人工細胞生產(chǎn)線

       借助Pico微注射系統(tǒng)就可以往脂質(zhì)小體這種人造細胞膜結(jié)構(gòu)中添加各種蛋白質(zhì)。首先，脂質(zhì)小體被置于多聚體外殼內(nèi)，待其穩(wěn)定后將脂質(zhì)小體注入毛細通道。在電流的作用下，目標(biāo)蛋白就會被插入脂質(zhì)小體內(nèi)，或者脂質(zhì)小體的膜上。

       Spatz等人利用上圖這種設(shè)備在脂質(zhì)小體的膜上插入了ATP合酶蛋白質(zhì)（ATP synthase）。這些ATP合酶就好像一臺水車一樣，當(dāng)有質(zhì)子通過脂質(zhì)小體膜時，就可以利用ATP的前體物質(zhì)，生產(chǎn)出ATP。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GUV外部的酸性增強時，在GUV的內(nèi)部真的產(chǎn)生了ATP。

       Spatz表示，他們可以讓這些GUV再次通過毛細通道，添加其它蛋白質(zhì)，如此往復(fù)，就可以添加多種細胞組份。他們接下來就計劃加入其它成分，使GUV可以自己在膜內(nèi)外形成質(zhì)子梯度。這樣一來，就和我們?nèi)梭w內(nèi)一樣了，是非常重要的一環(huán)。

       德國馬堡馬克斯普朗克地球微生物研究所（Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology in Marburg, Germany）的生物化學(xué)家Tobias Erb也是研究合成生物學(xué)的，他們也在細胞代謝領(lǐng)域里有所發(fā)現(xiàn)。Erb關(guān)注的是光合作用微生物（photosynthetic microbes）利用二氧化碳生成糖和其它物質(zhì)的代謝途徑。

       Erb使用的是空板（blank-slate）方法來合成細胞代謝通路。據(jù)他介紹，從工程學(xué)的思維出發(fā)，我們首先思考的是如何設(shè)計，然后是如何將設(shè)計圖真的建造出來。

       Erb團隊設(shè)計了一個系統(tǒng)，可以將二氧化碳轉(zhuǎn)化成蘋果酸（malate），而蘋果酸就是光合作用最關(guān)鍵的代謝物。他們估計，這條代謝通路的效率要比光合作用的還要強。接下來，Erb團隊的工作就是在數(shù)據(jù)庫中搜索，看看都有哪些酶可以供他們使用。有些酶也許需要先改造一下才可以滿足他們的要求。

       最后，Erb團隊一共找到了17種酶，這些蛋白質(zhì)來自9種不同的生物。比如有大腸桿菌、古細菌（archaeon）、擬南芥（Arabidopsis）和人類。這個反應(yīng)不出意外的話，效率應(yīng)該是很低的。

       Erb指出，雖然他們將多種酶組合在一起，但結(jié)果并不理想。不過經(jīng)過人工改造之后，目前已經(jīng)升級到5.4版，反應(yīng)效率已經(jīng)比大自然中的光合作用強了20%。

       接下來，Erb等人又開始了人工葉綠體的打造工作。他們用研缽將菠菜碾碎，然后加入人造光合系統(tǒng)，結(jié)果在紫外光的照射下真的生成了ATP，也將二氧化碳轉(zhuǎn)化成了蘋果酸。Erb認為，雖然他們在試管中取得了成功，但是我們最終需要的是真正的人造葉綠體。他非常希望能夠與Kate Adamala等合成生物學(xué)家合作，構(gòu)建出復(fù)雜的細胞器。

       美國明尼蘇達大學(xué)（University of Minnesota in Minneapolis）的Kate Adamala實驗室正在開發(fā)可控生物反應(yīng)器（programmable bioreactors）。他們的方案就是將簡單的生物通路置入脂質(zhì)小體，然后將這些人造細胞聚集起來，形成復(fù)雜的生物反應(yīng)器。她將這個系統(tǒng)比喻做“可以制造蛋白質(zhì)的肥皂泡”。

       Adamala團隊使用和Schwille等人類似的試管旋轉(zhuǎn)方法來制造她們的生物反應(yīng)器，不過她們生成的脂質(zhì)小體個頭會小一點。Adamala團隊在其中還加入了編碼各種蛋白質(zhì)的質(zhì)粒，以及整個蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)。

       比如，她們就制造了一種生物反應(yīng)器，可以感知所處環(huán)境里的抗生素水平，因為當(dāng)抗生素分子通過脂質(zhì)小體膜上的小孔進入生物反應(yīng)器內(nèi)部時，就會產(chǎn)生生物發(fā)光信號（bioluminescent signal）。

       如果將一個個生物反應(yīng)器按照一定的順序組合起來，就可以打造出一套更加復(fù)雜的生物反應(yīng)通路。但是當(dāng)反應(yīng)器（或組份）的數(shù)量超過十個時，這個系統(tǒng)就崩潰了。這是目前合成生物學(xué)領(lǐng)域里面臨的挑戰(zhàn)。在真正的細胞里，可能會彼此影響的蛋白質(zhì)都被分隔在不同的細胞器里。因此，科研人員必須想辦法，了解如何在結(jié)構(gòu)簡單的人造細胞里控制這些蛋白質(zhì)的作用，以避免它們相互影響。比如可以建造一套外部的門控系統(tǒng)，由操作人員來決定這些脂質(zhì)小體什么時候組合，什么時候分開。還可以添加一些化學(xué)標(biāo)簽，控制不同的脂質(zhì)小體之間的結(jié)合，或者使用時間釋放控制系統(tǒng)（time-release system）等。

       再來點信息

       人工合成細胞除了上面那些“硬件”條件之外，還有一個重要的因素，那就是需要相應(yīng)的“軟件”。如何讓人工合成細胞“聽話”，這就需要信息的引導(dǎo)和指揮了。在真正的生命體（從微生物到人類）內(nèi)，這就是基因負責(zé)的工作。

       那么在人工合成細胞里需要多少個基因呢？這一直是大家爭論的焦點。Schwille等人認為幾十個就夠了，可是Adamala等人卻堅持至少需要兩三百個。

       有些科研人員沒有選擇從頭開始的合成路線，而是選擇從活細胞開始。比如美國加州J. Craig Venter研究所的合成生物學(xué)家John Glass就使用目前地球上已知的、基因組最小的微生物——蕈狀支原體（Mycoplasma mycoides）為原材料，通過減少該基因組里基因的數(shù)量，來了解到底多少個（哪些）基因就足以支撐一個細胞的生存。他們得到實驗結(jié)果之后，就在實驗室里用化學(xué)合成的方法，重新制作了一個最簡基因組。

       這個最簡基因組一共含有473個基因，這只有蕈狀支原體原始基因組大小的一半。然后，Glass等人將這個人工基因組植入山羊支原體（Mycoplasma capricolum）細胞。2016年，Glass等人發(fā)現(xiàn)這個人工合成基因組可以維持細胞的存活，只不過細胞的生長速度比較慢。鑒于此，他認為，不能再減少基因的數(shù)量了，否則就會讓細胞死亡，或者無法維持細胞的生長。

       Glass等人正在根據(jù)他們最新的研究成果JCVI-syn3.0a，編寫一部“細胞任務(wù)清單（cellular tasks）”，這也將成為制作最簡細胞的藍本。但是面對這大約100個基因，還是無法區(qū)分哪些屬于必需基因。

       接下來，Glass和Adamala在NSF提供的大約100萬美元的支持下，還將嘗試將JCVI-syn3.0a基因組組裝進脂質(zhì)小體里，這個脂質(zhì)小體里同時裝載了整套蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)，他們想看看這個徹頭徹尾的人工細胞是否可以存活。

       如果這個人工細胞可以正常地生長、繁殖，那么將是一個巨大的進步。但是很多人都不認為這是一個真正意義上的活體系統(tǒng)，因為它還得具有進化和環(huán)境適應(yīng)能力才行。Schwille認為，這也是的挑戰(zhàn)，是最難預(yù)料的。一個只能復(fù)制自己的東西還不能被稱作生命，真正的生命還需要發(fā)展出新的能力。

       Glass的團隊正在對他們的JCVI-syn3.0a進行適應(yīng)性進化實驗，他們在富營養(yǎng)環(huán)境中進行實驗，因為細胞在這種條件下的生長速度更快，更有利于選擇。到目前為止，細胞已經(jīng)分裂了400次，Glass等人已經(jīng)篩選出了生長速度比之前提升了15%的“新品種”。而且還觀察到了很多基因序列變異的情況。但是目前還沒有證據(jù)顯示這些細胞發(fā)展出了新功能，或者提高了適應(yīng)能力。

       Erb認為，給人造細胞添加進化能力，是唯一的出路。生物系統(tǒng)里的混亂（ messiness ）就是讓它們進步的動力。作為工程師，我們不能制造出一個完美的細胞。我們需要開發(fā)的是具有自我糾錯能力，能夠自己越變越好的細胞。

       這些人造細胞也可以告訴我們其它星球上的生命可能是什么樣子的。一個完全受控的生物反應(yīng)器也可以為我們開發(fā)新的抗癌藥和解決抗生素耐藥問題，并為清除毒物提供幫助。如果將這些人造細胞植入人體，或者自然環(huán)境中，還是有一定風(fēng)險的，但是自上而下地改造生命也同樣會帶來不可預(yù)知的風(fēng)險，甚至?xí)ｋU。

       Dogterom表示，人工合成細胞也會帶來倫理和哲學(xué)方面的問題，比如它們是生命體嗎？它們是自主的嗎？我們應(yīng)該控制它們嗎？這一定會在公眾與科研界之間引發(fā)爭論。至于這些人造細胞會自由發(fā)展、進化，Dogterom倒不是特別擔(dān)心，她相信至少第一批人造細胞還不會那么高級。作為合成生命工程師，她們也可以在人造細胞里加入控制開關(guān)，確保安全性。

       Dogterom等合成生物學(xué)家將繼續(xù)她們的工作。她表示，現(xiàn)在時機正好。我們有了人造基因組和其它所有需要的材料。細胞只需要數(shù)百個基因就可以存活。雖然幾百個也不是一件容易的事情，但好歹不是幾千個。

       原文檢索：

       Kendall Powell. (2018) BIOLOGY FROM SCRATCH. Nature, 563: 172-175.