深度 | 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測方法

       近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的進(jìn)步和CTC臨床應(yīng)用價(jià)值凸顯，許多研究機(jī)構(gòu)和研發(fā)團(tuán)隊(duì)都在推出不同的CTC檢測技術(shù)。由于血液中CTC的含量極低，目前主流的檢測方法是先捕獲（富集）后檢測，少量方法是不捕獲（富集）直接檢測。CTC檢測技術(shù)包括CTC的富集（分離）和CTC的分析鑒定（識別）。本篇文章將介紹CTC的富集和分析方法，尤其重點(diǎn)介紹CTC的富集方法。

       一、CTC富集方法的分類和原理

       人體循環(huán)系統(tǒng)中CTC的含量極低，腫瘤轉(zhuǎn)移患者每毫升全血中僅有1～10個(gè)CTC，因此要實(shí)現(xiàn)CTC的檢測對其進(jìn)行分選富集是一個(gè)關(guān)鍵的步驟。CTC分選富集效果的優(yōu)劣將會直接影響其后續(xù)的檢測效果，因此高純度、高靈敏性（不丟失CTC）、快速、高細(xì)胞活性的CTC分選富集是CTC臨床應(yīng)用的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

       CTC的富集方法可以分為生物化學(xué)特性富集法（親和性富集法）和物理特性富集法。親和性富集法主要是根據(jù)通過細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物分離靶細(xì)胞，包括正向捕獲CTC的陽性富集法和負(fù)向去除白細(xì)胞的陰性富集法。物理特性富集法主要是根據(jù)CTC的大小、密度、力學(xué)和介電性能等物理特性將CTC篩選出來。

       1.1 親和性富集法

       親和性富集法根據(jù)結(jié)合的靶細(xì)胞是CTC還是白細(xì)胞，可分為陽性富集法和陰性富集法。陽性富集法主要利用特異性抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原進(jìn)行特異性結(jié)合來富集CTC。CTC分為上皮細(xì)胞表型、間質(zhì)細(xì)胞表型和上皮間質(zhì)細(xì)胞混合表型，因此用于CTC陽性富集的特異性抗體分為識別上皮標(biāo)志物、識別間質(zhì)標(biāo)志物和識別上皮間質(zhì)標(biāo)志物三種。其中，上皮標(biāo)志物在正常上皮細(xì)胞和上皮腫瘤（即癌）上表達(dá)，但在間質(zhì)白細(xì)胞上不存在，因此經(jīng)常用于區(qū)分癌細(xì)胞和正常血細(xì)胞。上皮細(xì)胞粘附分子（EpCMA）是最常用于上皮表型CTC陽性富集的細(xì)胞表面標(biāo)志物。此外，由于細(xì)胞骨架蛋白對于上皮細(xì)胞具有特異性，細(xì)胞角蛋白家族成員（即CK8，CK18和CK19）已經(jīng)成為檢測具有上皮表型癌癥患者CTC的“金標(biāo)準(zhǔn)”標(biāo)記物。陰性富集法也稱白細(xì)胞去除法，通常用識別CD45或CD14的特異性抗體與白細(xì)胞結(jié)合，從而去除全血中的白細(xì)胞。

       除了特異性抗體，親和性結(jié)富集法的某些技術(shù)采用與CTC或白細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合的多肽或適配體（aptamer，一種單鏈DNA或RNA分子，與目的蛋白有很高的親和力和特異性）替代抗體來實(shí)現(xiàn)陽性或陰性富集。

       生化特性富集法

       資料來源：NatRev Cancer. 2014 Sep;14(9):623-3

       1.1.1 免疫磁珠技術(shù)

       親和性富集法目前基于免疫磁珠技術(shù)和微流控芯片技術(shù)對CTC進(jìn)行富集。免疫磁珠技術(shù)是根據(jù)免疫親和的原理，將免疫磁珠與捕獲抗體或特異性多肽（可與血液中的CTC或白細(xì)胞表面抗原相結(jié)合）相連接，隨后通過磁場即可將磁珠捕獲與未捕獲的細(xì)胞分離。

       基于免疫磁珠技術(shù)的親和性富集法的原理

       1.1.2 微流控芯片技術(shù)

       微流控（microfluidics）是一種精確控制和操控微尺度流體，以在微納米尺度空間中對流體進(jìn)行操控為主要特征的科學(xué)技術(shù)。微流控芯片是微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)的主要平臺和技術(shù)裝置，因其樣品量小、流速可控及構(gòu)件透明性等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于CTC的分選富集中。微流體芯片技術(shù)基于親和性富集法分離CTC時(shí)，芯片內(nèi)部的微通道或微結(jié)構(gòu)上修飾能夠與CTC或白細(xì)胞表面抗原結(jié)合的特異性抗體或適配體，當(dāng)血液流經(jīng)芯片時(shí)，特異性抗體或適配體可與目的細(xì)胞表面抗原結(jié)合，隨后將CTC或白細(xì)胞粘附在芯片上，實(shí)現(xiàn)CTC的陽性捕獲或陰性富集。

       基于微流體芯片技術(shù)的親和性富集法的原理

       資料來源：生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展2015,42(4): 301~312

       1.2 物理特性富集法

       物理特性富集法根據(jù)物理性質(zhì)來分離CTC，包括大小、密度、力學(xué)和介電性質(zhì)。從大小上來看，CTC的直徑約為10-20μm，而血細(xì)胞大小為7-12μm，通過過濾可留下體積較大的CTC。從密度上來看，CTC的密度較白細(xì)胞和紅細(xì)胞密度小，通過密度梯度離心可實(shí)現(xiàn)CTC分離。除了大小和密度的差異，一些技術(shù)也利用CTC和血細(xì)胞之間的力學(xué)和介電性質(zhì)差異來捕獲CTC。具體來說，CTC的可變形性不及血細(xì)胞。另外，CTC的膜電容通常較血細(xì)胞低，在一定強(qiáng)度的電場中，其遷移率與血細(xì)胞會產(chǎn)生差異。微流控技術(shù)除了在親和性富集法中有廣泛應(yīng)用外，在物理特性富集法中也有應(yīng)用。微流控芯片根據(jù)CTC與血細(xì)胞物理特性的差異，通過在芯片中設(shè)置不同的微結(jié)構(gòu)單元將其從血液中分離出來，常用的微結(jié)構(gòu)包括微孔、微過濾網(wǎng)和微柱等。

       1.3 生化和物理特性相結(jié)合的方法

       此外，也有一些技術(shù)將CTC的物理和生物化學(xué)特性結(jié)合起來用于CTC富集。如CTC-iChip，其基于CTC大小和表面標(biāo)志物的表達(dá)情況進(jìn)行CTC富集。該技術(shù)首先根據(jù)細(xì)胞大小，將較小的紅細(xì)胞和血小板過濾出去，留下白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。然后，用識別EpCAM的磁珠偶聯(lián)抗體對CTC進(jìn)行免疫染色，在磁場中捕獲并收集在芯片上。或者用識別CD45的磁珠偶聯(lián)抗體去除白細(xì)胞后收集CTC。

       生化和物理特性相結(jié)合的富集法（以CTC-iChip為例）

       二、CTC富集技術(shù)的發(fā)展歷程和趨勢

       2.1 發(fā)展歷程

       從技術(shù)發(fā)展史來看，CTC富集技術(shù)分為三代：第一代為基于物理特性的粗分離技術(shù)，第二代為基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)，第三代為基于物理或生化特性的微流控芯片技術(shù)。

       2.1.1 基于物理特性的粗分離技術(shù)

       基于物理特性的粗分離技術(shù)通過特殊濾膜裝置、密度梯度離心將CTC分離出來。這些技術(shù)操作簡單成本低廉，不依賴細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，捕獲的細(xì)胞數(shù)量多，但是由于CTC物理特性的異質(zhì)性，難以富集到高純度的CTC。

       基于物理特性的粗分離技術(shù)

       2.1.2 基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)

       基于生化特性的免疫磁珠技術(shù)通過免疫磁珠偶聯(lián)的抗體或多肽正向或負(fù)向篩選出CTC。由于技術(shù)的限制，早期的磁珠只能達(dá)到微米級。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在使用的磁珠大都為納米級，其增大的比表面積增加了與待測細(xì)胞的接觸幾率，更好的分散性降低了對細(xì)胞造成的機(jī)械性壓力，大大提高了CTC的富集率。最典型的基于免疫磁珠富集CTC的技術(shù)平臺是強(qiáng)生子公司veridex的CellSearch，其是全球目前唯一同時(shí)經(jīng)過FDA和CFDA批準(zhǔn)的用于CTC檢測的商業(yè)化產(chǎn)品。該產(chǎn)品由于檢測靈敏度不高，且無法分離活體CTC，2016年初已停產(chǎn)。除了CellSearch之外，也有多種技術(shù)平臺基于免疫磁珠技術(shù)捕獲CTC，如AdnaGen公司（已被Qiagen收購）的AdnaTest，Miltenyi公司的MACS，Illumina公司的MagSweeper。

       用于CTC檢測的CellSearch平臺。（A）將血液吸入含有EDTA和細(xì)胞保護(hù)劑的CellSave保護(hù)管中;（B）將7.5mL血液轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的管中并離心以分離固體血液成分和血漿;（C）樣品放入CELLTRACKS?AUTOPREP? 系統(tǒng)中，吸出血漿并將樣品重懸于緩沖液中;（D）添加偶聯(lián)EpCAM抗體的磁性納米顆粒并與EpCAM陽性細(xì)胞結(jié)合，從而“富集”上皮來源的CTC。然后將磁珠結(jié)合的細(xì)胞與其他細(xì)胞通過磁性分離;（E）CTC用CK8，CK18和CK19抗體染色。CD45陽性染色細(xì)胞被認(rèn)為是白細(xì)胞，并被排除在分析之外;（F）應(yīng)用DAPI染色細(xì)胞核;（G）施加磁力以分離磁珠結(jié)合的EpCAM陽性細(xì)胞;（H）CK陽性、DAPI陽性、CD45陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是CTC用于進(jìn)一步分析。

       資料來源：TranslLung Cancer Res. 2017 Aug;6(4):473-485

       2.1.3 微流控芯片技術(shù)

       微流控芯片技術(shù)基于CTC的物理特性或生化特性或兩種特性的結(jié)合來富集CTC，所需樣品量小、流速可控而且能夠捕獲活細(xì)胞。微流控芯片技術(shù)目前已經(jīng)歷了三代的發(fā)展過程：第一代芯片為以CTC-Chip為代表，第二代芯片以HB-Chip為代表，第三代芯片以CTC-iChip為代表。

       微流微柱富集：該類芯片基于CTC與血細(xì)胞生化特性的差異，在芯片中設(shè)置微柱陣列將其從血液中分離出來。此類芯片以CTC-Chip為代表，該芯片是第一個(gè)使用微流體技術(shù)富集CTC的裝置。CTC-Chip由78,000個(gè)微柱陣列組成，微柱被識別EpCAM的抗體包被，微柱的幾何排列和流體流速被優(yōu)化以促進(jìn)細(xì)胞附著到抗體包被的柱上。除了CTC-Chip，也有一些公司開發(fā)基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片富集CTC，如Captura公司的GEDI-Chip，Biocept公司的OncoCEE?；谖⒅Y(jié)構(gòu)的芯片由于復(fù)雜的微柱設(shè)計(jì)很難在大規(guī)模的基礎(chǔ)上進(jìn)行高通量生產(chǎn)。此外，目前用于CTC檢測和表征的技術(shù)嚴(yán)重依賴于免疫細(xì)胞化學(xué)和需要高分辨率成像的其他技術(shù)，這在非透明三維微柱陣列的存在下是困難的。

       第一代芯片CTC-Chip

       資料來源：TranslLung Cancer Res. 2017 Aug;6(4):473-485

       微流表面富集：由于基于微柱結(jié)構(gòu)的芯片的局限性，表面捕獲的微流體芯片被開發(fā)，這些芯片使用抗體包被的表面裝置捕獲CTC。表面捕獲裝置的簡化架構(gòu)更適合于大規(guī)模生產(chǎn)，并且還允許制造更易于成像的透明裝置。此類芯片以HB-Chip為代表，其微流道的結(jié)構(gòu)為魚骨形（HB），表面被識別EpCAM的抗體包被，血液流過一個(gè)可視通道，通道內(nèi)魚骨形溝回能夠引起血液的一個(gè)輕微斡旋，從而增強(qiáng)了其與抗體修飾表面的接觸。與第一代CTC芯片相比，第二代的HB芯片制作更為簡單，且可更高效地捕獲腫瘤細(xì)胞，捕獲效率約90%。后人在第二代的基礎(chǔ)上加上了aptamer（結(jié)合CTC表面的EpCAM），進(jìn)一步提高了CTC的捕獲效率。除了HB-Chip，GEM-Chip、GO-Chip以及BioFluidica公司的ModularSinusoidal Microsystem也都采用表面裝置捕獲CTC。使用表面捕獲裝置的一個(gè)挑戰(zhàn)是下游處理的靈活性，捕獲的CTC被固定在裝置的表面上，并且難以恢復(fù)以進(jìn)行進(jìn)一步分析。在胰蛋白酶消化后可以釋放在這些裝置中捕獲的細(xì)胞，然而胰蛋白酶很可能切割用于后續(xù)分析的許多感興趣的表面受體。

       第二代芯片HB-Chip

       資料來源：TranslLung Cancer Res. 2017 Aug;6(4):473-485

       微流免疫磁珠富集：目前已經(jīng)有多家公司或研究單位應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)來解決表面捕獲裝置的局限性，該技術(shù)能很好地控制細(xì)胞捕獲與釋放。此類芯片以CTC-iChip為代表，該芯片將免疫磁珠和微流控技術(shù)結(jié)合起來用于CTC富集。CTC-iChip首先使用塑料微柱陣列將小個(gè)的紅細(xì)胞和血小板過濾出去，然后在磁場中通過“慣性聚焦”作用將較大的細(xì)胞排成一行，并使用陽性或陰性富集方法分離CTC與白細(xì)胞。CTC-iChip的捕獲效率可以高達(dá)98%，但是對于直徑較?。?lt;8微米）的CTC并不適用。除了CTC-iChip，也有多種芯片技術(shù)使用免疫磁珠富集CTC。如Ephesia公司的Ephesia，Cynvenio公司的LiquidBiopsy，F(xiàn)luxion公司的Isoflux，這些芯片的捕獲效率與第二代芯片相近，為90%左右。

       上述芯片主要基于CTC的生化特性將其從血液中分離出來，具有特異性高的優(yōu)點(diǎn)，能有效分選形狀、大小相似的不同種類細(xì)胞。目前大部分技術(shù)采用EpCAM作為CTC的表面特異性抗原，但是在不同的腫瘤亞型中，EpCAM的表達(dá)各不相同。依賴EpCAM的CTC分選芯片會丟失不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的CTC，然而這些CTC具有更大的浸潤性和侵入性。因此，缺乏公認(rèn)的表面標(biāo)志物限制了親和性富集在CTC分選中的應(yīng)用。

       為了無需依賴表面標(biāo)志物，也有一些微流控芯片基于物理特性富集CTC，目前主要有基于細(xì)胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)，基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的芯片技術(shù)和基于細(xì)胞介電性質(zhì)的雙向電泳技術(shù)。

       基于細(xì)胞大小和變形性差異的芯片技術(shù)：該技術(shù)通過在芯片內(nèi)部設(shè)計(jì)不同的小于CTC直徑的微孔、微過濾網(wǎng)、微柱等結(jié)構(gòu)，當(dāng)含有CTC的樣品流經(jīng)芯片時(shí)，CTC由于直徑大而被卡在結(jié)構(gòu)內(nèi)，血細(xì)胞則隨緩沖液一起流出，較大的白細(xì)胞被結(jié)構(gòu)捕獲時(shí)，由于CTC比白細(xì)胞變形性小，加大緩沖液流速時(shí)，白細(xì)胞被沖走，CTC則留在芯片內(nèi)，從而達(dá)到分離目的。Abnova公司的ClearCell?CXSystem就是基于此原理分離CTC的代表，該系統(tǒng)還可以動態(tài)監(jiān)測CTC的捕獲過程。芯片主要結(jié)構(gòu)由圓柱形微柱構(gòu)成，每個(gè)捕獲單元由三個(gè)圓柱排列組成一個(gè)“爪形”結(jié)構(gòu)。

       ClearCell?CXSystem結(jié)構(gòu)示意圖

       基于細(xì)胞大小和變形性差異分選CTC的優(yōu)勢在于：操作過程簡單，捕獲效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量富集，成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CellSearch，無需依賴表面標(biāo)志物，分選出的CTC可以用多種抗體進(jìn)行標(biāo)志物鑒別。該方法存在的問題是僅僅基于細(xì)胞尺寸和變形性不同而進(jìn)行過濾式分選，由于CTC尺寸和白細(xì)胞有重疊部分，CTC有可能會通過濾網(wǎng)或微柱的間隔；而且在較大的機(jī)械力作用下，CTC隨著緩沖液流過微柱或者濾網(wǎng)時(shí)容易破裂。這些因素會對分離純度和細(xì)胞活性造成一定影響，這類芯片在設(shè)計(jì)內(nèi)部捕獲單元時(shí)應(yīng)避免使用帶棱角的微柱，比如三角形、長方形、正方形等。

       基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的芯片技術(shù)：這些技術(shù)主要基于慣性力或確定性側(cè)向位移?；趹T性力的慣性微流技術(shù)通過使用兩種力（梯度剪切升力和管壁效應(yīng)升力）在微流體裝置中應(yīng)用慣性效應(yīng)，基于尺寸被動地將CTC與其他血細(xì)胞分離。這些升力的大小和方向取決于通道尺寸，通道縱橫比，流速和顆粒直徑。目前該技術(shù)的商業(yè)化平臺主要有Vortex（直線型通道）和ClearCellFX（單螺旋通道）。

       ClearCellFX芯片

       資料來源：LabChip. 2014 Jan 7;14(1):128-37

       基于確定性側(cè)向位移設(shè)計(jì)的微流控芯片原理是芯片內(nèi)具有相對于流體流動方向呈一定角度的微柱陣列，尺寸不同的顆粒在流動過程中具有不同的運(yùn)動軌跡，尺寸大的顆粒會發(fā)生側(cè)向位移向一側(cè)匯聚，尺寸小的顆粒會按原軌跡運(yùn)動，在芯片上設(shè)計(jì)相應(yīng)的兩個(gè)出口，即可收集到相應(yīng)的細(xì)胞。

       基于細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)差異分選同基于細(xì)胞大小和變形性差異分選一樣，裝置簡單、無需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、成本低。樣品無需標(biāo)記，不影響CTC分子特性和表面標(biāo)志物；細(xì)胞在微流環(huán)境中損傷小，分選后細(xì)胞的存活率更高，可繼續(xù)培養(yǎng)和做后續(xù)分析。然而，由于血液的復(fù)雜性，細(xì)胞間的相互作用不容易控制，當(dāng)處理細(xì)胞濃度較高的樣品時(shí)，分選效率降低。另外，該方法單純基于細(xì)胞的物理特性實(shí)現(xiàn)，而人體血液是高度復(fù)雜的血漿、紅白細(xì)胞、血小板、蛋白質(zhì)混合物，且血液黏度是水的3倍以上，因此芯片有時(shí)容易發(fā)生堵塞現(xiàn)象，影響分選效率，分選出的CTCs可能存在假陽性結(jié)果。

       基于細(xì)胞介電性質(zhì)的雙向電泳技術(shù)：雙向電泳（DEP）是微流控芯片上一種常用的細(xì)胞分選方法，其原理是不同類型的細(xì)胞在電場中介電性質(zhì)不同，所受介電力的大小和方向不同，在不同介電力作用下向不同方向移動，在電場中實(shí)現(xiàn)目的細(xì)胞的分選。目前，商業(yè)化的雙向電泳技術(shù)主要有ApoCell公司的ApoStream，SiliconBiosystems公司的DEPArray。

       雙向電泳法的優(yōu)勢是可將不同癌種表面標(biāo)志物表達(dá)相同、尺寸相似、形態(tài)相似的細(xì)胞分離出來。但是在較大的流速下，微弱的電泳力沒有充足時(shí)間感應(yīng)流過的CTC，從而難以達(dá)到快速分選。該方法存在的另一個(gè)問題是電場力可能會對細(xì)胞活性和表面特性產(chǎn)生影響，不利于對CTC進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)和分子特性分析。雙向電泳法分選時(shí)間長，但準(zhǔn)確率高，因此，較適合于少量細(xì)胞的分選。

       CTC富集技術(shù)的發(fā)展歷程

       2.2 發(fā)展趨勢

       2.2.1 微流控芯片技術(shù)有望得到更廣泛應(yīng)用

       微流控芯片技術(shù)由于其自身特點(diǎn)在細(xì)胞分選方面具有一定的優(yōu)勢，包括芯片體積小、速度快、通量高、操作簡便、樣品和試劑消耗低、易在芯片上集成多用途功能部件等．經(jīng)過十多年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)在CTC分選中越來越廣泛的應(yīng)用，有望在將來成為CTC富集和檢測工具之一。該技術(shù)目前也面臨著一些技術(shù)上和臨床上的挑戰(zhàn)：芯片通道空間小，實(shí)驗(yàn)過程中管道容易被堵塞；有些特殊的芯片造價(jià)昂貴不便于推廣應(yīng)用；在進(jìn)行細(xì)胞分選時(shí)，有些方法難以確保較高的細(xì)胞活性；缺乏統(tǒng)一的CTC表面標(biāo)志物等．如何改進(jìn)微流控芯片技術(shù)在進(jìn)行細(xì)胞分選時(shí)所遇到的上述問題，充分發(fā)揮其優(yōu)勢，將是接下來研究的關(guān)鍵。

       2.2.2 開發(fā)納米技術(shù)和適配體在微流控芯片中的應(yīng)用

       CTC檢測的靈敏度和可靠性非常重要，7.5ml血液中有1～5個(gè)CTC在臨床上都是有意義的，假陰性和假陽性都可能對樣品分析、臨床診斷產(chǎn)生重要影響。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，功能化納米材料修飾的微流控芯片廣泛應(yīng)用于CTC的富集和檢測?？贵w連接的功能性納米粒子能夠?yàn)镃TC與抗體的結(jié)合提供更大的接觸表面積，因此納米技術(shù)也成為細(xì)胞分選中備受矚目的一項(xiàng)新技術(shù)。適配體能提供特異性CTC靶點(diǎn)，因此微流控芯片的應(yīng)用也許可以向基于新的CTC捕獲探針（如核酸適配體探針等）方面發(fā)展，尋找特異性強(qiáng)的適配體探針，以提高CTC檢測的可靠性。

       2.2.3 基于多種捕獲方法設(shè)計(jì)微流控芯片

       親和性富集法特異性高，能有效分選形狀、大小相似的不同種類細(xì)胞，但是陽性富集法大都使用EpCAM，會丟失不表達(dá)或低表達(dá)EpCAM的CTC，而陰性富集法只是去除了白細(xì)胞，CTC純度不高。物理特性富集法不依賴細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，捕獲的細(xì)胞數(shù)量多，能夠克服CTC在蛋白表達(dá)上的異質(zhì)性，但是無法克服CTC在物理特性的異質(zhì)性。因此，采用多種捕獲方法相結(jié)合，充分利用各自的優(yōu)點(diǎn)設(shè)計(jì)CTC捕獲微流控芯片是將來的發(fā)展趨勢。如第三代芯片CTC-iChip，其利用確定性側(cè)向位移、慣性聚焦和免疫磁珠富集CTC。

       CTC富集技術(shù)比較

       三、國內(nèi)外CTC公司的富集技術(shù)圖譜

       國外部分CTC公司的富集技術(shù)圖譜

       國外CTC公司在粗分離技術(shù)、免疫磁珠技術(shù)和微流控技術(shù)等方面均有布局，而且微流控技術(shù)應(yīng)用較多。這表明國外CTC公司緊隨技術(shù)發(fā)展趨勢，有望提高CTC的捕獲效率并將CTC檢測快速應(yīng)用于臨床。

       國內(nèi)CTC公司的富集技術(shù)圖譜

       目前國內(nèi)進(jìn)行CTC檢測的公司大約有20多家。與國外公司類似，國內(nèi)公司在粗分離技術(shù)、免疫磁珠技術(shù)和微流控技術(shù)等方面均有布局。然而不同的是，國內(nèi)公司基于生化特性的富集方法主要是免疫磁珠技術(shù)，微流控技術(shù)應(yīng)用較少，而基于物理特性的富集方法主要是微流控技術(shù)。這表明在微流控芯片技術(shù)方面，國內(nèi)公司的應(yīng)用程度低于國外公司。微流控芯片技術(shù)作為目前CTC捕獲技術(shù)發(fā)展的主要趨勢，可能會對國內(nèi)液體活檢公司帶來一場技術(shù)革新和升級。除了自主研發(fā)，國內(nèi)多家公司已經(jīng)與國外公司達(dá)成技術(shù)引進(jìn)或合作開發(fā)協(xié)議：博奧晶典和新加坡液體活檢公司Celsee合作獨(dú)家引入后者的CTC檢測技術(shù)平臺；麗珠集團(tuán)與美國Cynvenio公司合資組建了專注于液體活檢的麗珠圣美；貝達(dá)藥業(yè)與美國CapioBiosciences公司合作，引入了OncoSenseCTC捕獲技術(shù)。由此可見，國內(nèi)CTC公司仍需要緊跟技術(shù)發(fā)展趨勢，不斷研發(fā)CTC富集技術(shù)，提高細(xì)胞的捕獲效率和純度。

       四、CTC分析方法

       利用親和特性或物理特性法可富集到CTC，接下來還需要結(jié)合有效的下游分析方法。一方面，由于目前CTC捕獲技術(shù)不能保證百分之百的純度，需要對所得到的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，以進(jìn)一步確定CTC細(xì)胞的數(shù)目，以減少CTC數(shù)目判定的假陽性率和假陰性率。另一方面，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，不僅CTC的數(shù)目在動態(tài)的變化，CTC所攜帶的分子標(biāo)志物也在變化，通過對CTC表面標(biāo)志物檢測，能夠反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的有效策略，并能很好地指導(dǎo)臨床治療。常用的CTC分析技術(shù)如免疫熒光、PCR、FISH及高通量測序等。

       捕獲CTC的分析（檢測）技術(shù)

       資料來源：浙商證券

       小 結(jié)

       由于血液中CTC的含量極低，目前主流的檢測方法是先捕獲（富集）后檢測，少量方法是不捕獲（富集）直接檢測。CTC的富集方法主要是基于其生化特性或物理特性或兩種特性的結(jié)合，已經(jīng)歷了三代的發(fā)展歷程。微流控芯片技術(shù)憑借多種優(yōu)勢已經(jīng)在CTC分選中得到越來越廣泛的應(yīng)用，有望在將來成為CTC富集和檢測工具之一。但該技術(shù)也面臨著一些技術(shù)上和臨床上的挑戰(zhàn)，需要克服這些問題并充分發(fā)揮其優(yōu)勢。同時(shí)也需要采用多種捕獲方法相結(jié)合，充分利用各自的優(yōu)點(diǎn)設(shè)計(jì)CTC捕獲微流控芯片。與國外公司相比，國內(nèi)公司需要緊跟技術(shù)發(fā)展趨勢，加大微流控芯片技術(shù)在CTC富集方面的應(yīng)用。