由于環(huán)境與生活方式改變、生育年齡后延以及癌癥治療等諸多因素，近年來女性生育力明顯下降，我國(guó)不孕不育率已高達(dá)15%-20%，其中女性原因約占50%。排卵及卵成熟異常、卵巢功能低下等卵巢功能障礙是導(dǎo)致女性不孕的重要原因，人類卵母細(xì)胞體外成熟、卵泡體外培養(yǎng)體系等生育力保護(hù)保存技術(shù)還面臨很多難題。卵泡是維持女性卵巢功能的基本單元，而卵泡正常發(fā)育與成熟的分子機(jī)制尚未闡明，導(dǎo)致臨床上缺乏診療卵巢功能障礙的有效手段和保護(hù)生育力的有效措施。
胎兒期卵泡發(fā)生和青春期后卵泡發(fā)育是女性卵泡發(fā)育的兩個(gè)重要階段，前者與卵巢儲(chǔ)備密切相關(guān)，后者與受精、生育關(guān)系緊密。女性在胎兒期20周時(shí)，卵泡數(shù)量高達(dá)數(shù)百萬，但是在整個(gè)生育周期僅有400個(gè)左右發(fā)育為成熟的卵泡、排卵，99.9％的卵泡發(fā)生閉鎖和丟失。因此，卵泡發(fā)生、發(fā)育與成熟的分子機(jī)制的探討對(duì)認(rèn)識(shí)女性生育力維持與改善至關(guān)重要。小鼠卵泡發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究已有多篇報(bào)道，人類與嚙齒類動(dòng)物的卵泡發(fā)育時(shí)程與排卵模式都有種屬差異，所以研究人類卵泡發(fā)育對(duì)于揭示女性生育力建立、維持與下降機(jī)制具有重要的意義。既往人類卵泡研究主要將卵巢組織或多個(gè)卵泡作為整體進(jìn)行研究，而不同卵泡異質(zhì)性較大，不能體現(xiàn)卵母細(xì)胞與其周圍顆粒細(xì)胞各自功能與相互作用機(jī)制。因此，需要從單個(gè)卵泡水平分別揭示卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞基因表達(dá)特征及相互作用信號(hào)通路。
2018年11月21日，北京大學(xué)第三醫(yī)院?jiǎn)探茉菏繄F(tuán)隊(duì)在Molecular Cell發(fā)表題為Transcriptome Landscape of Human Folliculogenesis Reveals Oocytes and Granulosa Cells Interactions（人類卵泡發(fā)育過程轉(zhuǎn)錄調(diào)控及卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的相互作用）的研究論文，系統(tǒng)解析了人類卵泡發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)全景圖及卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞相互作用的基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律。這是該團(tuán)隊(duì)在人類生殖細(xì)胞發(fā)育研究領(lǐng)域里取得的又一重要進(jìn)展。
本研究中，課題組利用機(jī)械法和酶消化法處理人類卵巢組織并分離得到發(fā)育各階段的單個(gè)卵泡（原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡、排卵前卵泡），進(jìn)一步消化得到單個(gè)卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，繪制了人類卵泡發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)全景圖并解析了卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞互作規(guī)律。同時(shí)進(jìn)行了小鼠與人類卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)了參與調(diào)控卵泡發(fā)育的保守性和物種特異性基因（圖1）。
圖1 人卵泡發(fā)育過程基因表達(dá)調(diào)控
通過此項(xiàng)研究，研究人員發(fā)現(xiàn)：
（1）轉(zhuǎn)錄組顯示卵泡可聚為五個(gè)類群，原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇卵泡及排卵前卵泡，并與卵泡形態(tài)學(xué)分類一致。卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞各自差異基因表達(dá)模式具有顯著的發(fā)育階段特征。隨著卵泡發(fā)育，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)水平總體呈逐步上調(diào)趨勢(shì)。而顆粒細(xì)胞有絲分裂相關(guān)基因表達(dá)水平從原始卵泡到竇卵泡階段總體呈逐步上調(diào)趨勢(shì)，而從竇卵泡到排卵前卵泡階段表達(dá)下調(diào)。
（2）卵泡發(fā)育過程卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞存在階段特異表達(dá)基因。這些篩選出的階段特異性表達(dá)基因可作為每個(gè)階段卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的潛在特異性標(biāo)志物，有助于建立臨床上評(píng)價(jià)卵泡發(fā)育的客觀標(biāo)準(zhǔn)，為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備、監(jiān)測(cè)生育力水平、篩選卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志物提供了線索。
（3）卵泡激活的關(guān)鍵步驟是原始卵泡到初級(jí)卵泡的轉(zhuǎn)變。本研究提示Insulin、GnRH、Neurotrophin和mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因在初級(jí)卵泡中卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞中均顯著上調(diào)，可能參與原始卵泡階段到初級(jí)卵泡階段的激活調(diào)控，是完善體外卵泡培養(yǎng)體系的潛在靶點(diǎn)。
（4） 闡述人類卵泡發(fā)育過程卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的相互作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)NOTCH信號(hào)通路配體DLL3和JAG2主要在卵母細(xì)胞中表達(dá)，其受體NOTCH 2、NOTCH 3和下游靶基因HES1在相應(yīng)的顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，提示NOTCH信號(hào)介導(dǎo)了卵母細(xì)胞調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖和分化的事件。
（5） 揭示了在人與小鼠卵泡發(fā)育過程中基因表達(dá)具有保守性和特異性。研究發(fā)現(xiàn)在人和小鼠卵母細(xì)胞中有8838個(gè)共表達(dá)基因（5923個(gè)基因?yàn)楣芗一颍Ｔ诜枪芗一蛑校?557個(gè)基因在人不同階段的卵母細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，1358個(gè)基因具階段特異性。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，人和小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，POUF5、GJC1、TEAD2及BMP15等基因具有不同的表達(dá)模式，顯示出人和小鼠的差異；HAS3、HTR5A、SNPH及NRAP等基因在具有相同的表達(dá)模式，顯示出人和小鼠具有一定的保守性。
綜上，該研究繪制了人類卵泡發(fā)育過程的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示了卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化，闡釋不同發(fā)育階段卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征及互作規(guī)律，為尋找新的促進(jìn)體外卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟的方法奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)該研究有助于開發(fā)生育力下降早期監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)記、改進(jìn)r生育力保護(hù)保存臨床治療方案，最終提高優(yōu)生優(yōu)育水平。
據(jù)悉，北京大學(xué)第三醫(yī)院?jiǎn)探芙淌凇?yán)杰副研究員與閆麗盈研究員為論文共同通訊作者。北京大學(xué)第三醫(yī)院張曜耀博士、北大清華生命科學(xué)聯(lián)合中心博士研究生嚴(yán)智強(qiáng)以及北京大學(xué)第三醫(yī)院碩士研究生覃清圓為并列第一作者。
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