腫瘤無創(chuàng)診斷技術(shù)在癌癥檢測中應(yīng)用

       腫瘤無創(chuàng)診斷技術(shù)即液體活檢（liquid biopsies）的出現(xiàn)，標(biāo)志著人類在攻克腫瘤的道路上又前進(jìn)了一大步。2015年液體活檢技術(shù)被MIT科技綜述雜志（MIT Technology Review）評(píng)為年度十大突破技術(shù)之一；2017年6月，世界經(jīng)濟(jì)論壇與《科學(xué)美國人》雜志的專家委員會(huì)聯(lián)合選出的2017年度全球十大新興技術(shù)榜單，其中腫瘤的無創(chuàng)診斷技術(shù)成功入選并榮膺榜首。

       一、液體活檢產(chǎn)業(yè)鏈分布

       從產(chǎn)業(yè)鏈來看，液體活檢可分為6個(gè)子領(lǐng)域，即上游的捕獲、基因擴(kuò)增、試劑以及儀器市場；中游檢測服務(wù)市場以及下游數(shù)據(jù)市場。

       1. 上游產(chǎn)品技術(shù)壁壘高，涉足企業(yè)少

       目前液體活檢尤其是CTC檢測技術(shù)受上游捕獲方式的局限較大，是限制液體活檢應(yīng)用的難點(diǎn)，器械主要包括CTC分析儀、數(shù)字PCR儀、二代測序儀等，試劑盒的關(guān)鍵原材料是抗體和芯片。這些技術(shù)、儀器和原材料的生產(chǎn)技術(shù)壁壘很高，專利保護(hù)嚴(yán)格，國外公司（賽默飛世爾、奧林巴斯等）形成了高度市場壟斷。國內(nèi)已有幾家公司通過并購實(shí)現(xiàn)二代測序儀的生產(chǎn)，但產(chǎn)品性能與國外產(chǎn)品相比差距較大，產(chǎn)品同質(zhì)化嚴(yán)重，競爭激烈。

       2. 中游檢測服務(wù)市場企業(yè)布局較多

       液體活檢技術(shù)可應(yīng)用于腫瘤的早期篩查、檢測、用藥指導(dǎo)、評(píng)估、觀察，貫穿癌癥診治全程，目前液體活檢的研究和應(yīng)用涵蓋腫瘤篩查、腫瘤分期分級(jí)、預(yù)后評(píng)估、精準(zhǔn)用藥（個(gè)體化治療）、耐藥監(jiān)控、腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)多個(gè)領(lǐng)域。更多的企業(yè)布局在中游檢測服務(wù)市場，通過渠道快速占有市場或積累樣本厚積薄發(fā)。

       3. 下游環(huán)節(jié)主要依賴銷售能力與測序環(huán)節(jié)后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理以及解讀

       數(shù)據(jù)解讀需要對(duì)癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)的深度認(rèn)知作為支持，因此不僅需要聯(lián)合測序技術(shù)與組學(xué)研究，還依賴于測序樣本的積累，但由于液體活檢并不是主要的腫瘤檢驗(yàn)方式且價(jià)格偏高，尚不能進(jìn)入醫(yī)保目錄，受眾規(guī)模小，醫(yī)院采購量有限，中游企業(yè)對(duì)銷售渠道的依賴比較嚴(yán)重，目前涉足企業(yè)有藥明康德、華大基因、首度基因、貝瑞和康等少數(shù)企業(yè)。

       4. 全國集聚情況

       對(duì)火石數(shù)據(jù)庫中101家液體活檢企業(yè)全國分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，上海、北京、廣州三省市排名前三，分別為20家，19家和17家；其次為江蘇和浙江，分別為13家和11家。

       二、液體活檢技術(shù)簡介

       目前，臨床研究中，液體活檢技術(shù)主要包括游離循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）檢測、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）檢測、外泌體及循環(huán)RNA（Circulating RNA）檢測等，與傳統(tǒng)的組織活檢相比，液體活檢具備實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測、克服腫瘤異質(zhì)性、提供全面檢測信息等獨(dú)特優(yōu)勢。

       1. CTC檢測：技術(shù)發(fā)展快，臨床研究熱度高

       CTC技術(shù)主要通過檢測血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC，Circulating Tumor Cells）的數(shù)量來進(jìn)行診斷。通過對(duì)血液中CTC的數(shù)量以及蛋白表達(dá)、序列檢測等可以獲取腫瘤的病變信息。目前，CTC主流技術(shù)主要分為以下幾種：Oncoquick（基于細(xì)胞密度對(duì)CTCs進(jìn)行分離）、ISET（依據(jù)細(xì)胞大小使用孔徑約8微米濾膜分離CTCs）、MACS（通過免疫磁珠標(biāo)記進(jìn)行上皮性CTCs的分離）、Cell Search（使用EpCAM抗體包被的鐵磁珠進(jìn)行免疫分離）、IFISH-CTC（免疫熒光染色結(jié)合FISH技術(shù)進(jìn)行非血緣性細(xì)胞染色體異常檢測）、RT-PCR（基于腫瘤特異性基因的表達(dá)分析）、AdnaTest（通過特定抗原表達(dá)和腫瘤相關(guān)標(biāo)志物分離，提取RNA進(jìn)行RT-PCR分析）、CTC-chip（使用含包被EpCAM抗體微柱陣列的芯片）。

       截至2018年4月，全球共有CTC檢測相關(guān)研究589項(xiàng)，其中美國259項(xiàng)，中國96項(xiàng)。

       在成果轉(zhuǎn)化方面，僅有Immunicon公司的Cellsearch CTC 檢測系統(tǒng)2004年通過FDA認(rèn)證，也是唯一通過FDA批準(zhǔn)用于臨床的一代CTC檢測系統(tǒng)，可以說是行業(yè)內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)。2012年Cellserach系統(tǒng)通過CFDA認(rèn)證進(jìn)入中國市場。Immunicon公司已被強(qiáng)生子公司Veridex所收購。盡管一代CTC技術(shù)領(lǐng)先進(jìn)入臨床應(yīng)用，但目前技術(shù)水平尚不完善，只能用于對(duì)CTC數(shù)量的檢測，無法進(jìn)行進(jìn)一步的深入檢測，加上靈敏度較低，應(yīng)用局限于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌。

       2. ctDNA檢測：市場處于萌芽期，亟待攻克技術(shù)局限性

       ctDNA技術(shù)通過對(duì)血液中ctDNA是否攜帶有腫瘤特異性的突發(fā)，或其他基因組改變信息進(jìn)行檢測。研究結(jié)果表明，該技術(shù)能夠真實(shí)反映實(shí)體瘤組織中的基因突發(fā)圖譜頻率，是治療效果評(píng)價(jià)與治療后臨床隨訪的重要監(jiān)測指標(biāo)。ctDNA檢測技術(shù)目前主要為數(shù)字 PCR、BEAMing 技術(shù)、標(biāo)記擴(kuò)增深度測序（TAM-Seq）、癌癥個(gè)體化深度測序（Capp-Seq）。

       ctDNA的檢測平臺(tái)目前有二代基因測序和數(shù)字化PCR，可分別對(duì)ctDNA的序列信息和序列數(shù)量做檢測，適用于非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、皮膚癌等常見腫瘤，檢測的目標(biāo)基因目前多以KRAS、PTEN、EGFR、BRAF等熱門基因?yàn)橹?。ctDNA的片段捕獲需要提前知道和準(zhǔn)備待檢測突變，突變文庫的制備過程繁瑣且高成本。與CTC相比，二者均屬于液體活檢范疇，高靈敏度和低成本，適用于大多數(shù)腫瘤檢測，并且可同時(shí)從血液中提取，獲得互補(bǔ)信息。

       截至2018年4月13日，全球共有ctDNA檢測相關(guān)研究212項(xiàng)，其中美國56項(xiàng)，中國30項(xiàng)。

       2016年4月，美國FDA批準(zhǔn)了Epigenomics公司以血液為基礎(chǔ)篩查結(jié)直腸癌的EpiproColon技術(shù)。EpiproColon（Septin9基因甲基化檢測試劑盒）能檢測血液中Septin9基因V2區(qū)域發(fā)生甲基化的CpG島bisDNA序列。臨床數(shù)據(jù)顯示EpiproColon可檢出68%的病例。這是FDA批準(zhǔn)的第一款基于ctDNA進(jìn)行腫瘤篩查的產(chǎn)品。

       3. 外泌體(exosome)檢測，液體活檢新技術(shù)

       外泌體與腫瘤發(fā)展：外泌體是腫瘤診斷、腫瘤發(fā)展和腫瘤治療的重要參與者。外泌體的主要功能就是遞送各種生物分子，包括蛋白質(zhì)、多肽配體、DNA和RNAs。因此腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體在腫瘤發(fā)展和治療中扮演角色主要表現(xiàn)在以下方面：1、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展，侵襲和轉(zhuǎn)移；2、促進(jìn)腫瘤的血管新生；3、腫瘤免疫調(diào)節(jié)；4、腫瘤化療的增敏作用。

       通過超速離心法或者磁珠法提取外泌體后，分離純化出來的exosome可以做蛋白研究，也可以做RNA（microRNA和LncRNA）研究，36%的研究人員通過Western blot或其他方法來鑒定蛋白，29%的人員利用qPCR對(duì)microRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，9%利用芯片進(jìn)行microRNA表達(dá)譜分析。同時(shí)，新一代測序的用戶也不少，13%的人員利用NGS開展microRNA/小RNA研究，9% 開展mRNA研究，另外基于組學(xué)研究的質(zhì)譜分析法也越來越常用。外泌體分析數(shù)據(jù)庫 ExoCarta，目前已包含9769種蛋白質(zhì)，4946種mRNA條目，3408種mRNA，2838種miRNA，1116種脂質(zhì)條目。

       外泌體（exosome）近年來成了研究領(lǐng)域里的明星，大量的相關(guān)研究見諸報(bào)道。尤其2015年以來外泌體研究與應(yīng)用飛速發(fā)展，國自然基金外泌體中標(biāo)項(xiàng)目和文章發(fā)表數(shù)量大幅增加。

       目前外泌體的大部分工作還是停留在科研階段，后續(xù)的生物標(biāo)志物開發(fā)和驗(yàn)證不多，而診斷和療法的開發(fā)就更少。研究者認(rèn)為，exosome的定性和定量研究是個(gè)快速發(fā)展的市場。同時(shí)，循環(huán)生物標(biāo)志物的市場也存在著機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

       三、液體活檢行業(yè)面臨的問題

       1. 液體活檢僅被作為替補(bǔ)方案，難以搶占傳統(tǒng)活檢市場份額

       患者如何在液體活檢和組織活檢之間選擇，取決于檢查的目的是什么。許多腫瘤的CTC、ctDNA數(shù)量不足或者腫瘤存在明顯異質(zhì)性，導(dǎo)致腫瘤即使突變，液體活檢試劑盒也不一定能捕捉到CTC或ctDNA，血液檢查結(jié)果可能出現(xiàn)假陰性。因此只要患者能夠提供足夠的組織樣本，初始診斷優(yōu)先選擇組織活檢；如果組織樣本不足量，液體活檢可以是替補(bǔ)方案。因此，液體活檢不會(huì)替代其他檢查方式，也難以搶占傳統(tǒng)活檢的市場份額。

       2. 液體活檢尚未進(jìn)醫(yī)保，價(jià)格高，推廣難度大

       低通量液體活檢產(chǎn)品價(jià)格低廉，但是檢出率也較低，應(yīng)用前景有限。高通量產(chǎn)品對(duì)部分腫瘤的檢出率高達(dá)80%-90%，但價(jià)格偏高。同時(shí)，這類產(chǎn)品尚未納入醫(yī)保目錄，普通民眾較難獨(dú)立接受如此高昂的價(jià)格。

       3. 對(duì)ctDNA產(chǎn)品的可靠性質(zhì)疑

       年初，美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）在《Journal of Clinical Oncology》雜志發(fā)表的綜述文章，對(duì)ctDNA的分析有效性、臨床有效性和臨床實(shí)用性提出質(zhì)疑。調(diào)查結(jié)果顯示：（1）以前的部分研究指出，ctDNA更適合用于晚期癌癥的篩查，而非用于臨床早篩，但是目前看來，即使用于晚期癌癥，其有效性和合理性也沒有足夠的證據(jù)來證明；（2）還沒有足夠的證據(jù)支持常規(guī)使用ctDNA檢測早期癌癥，并以此做出治療決策、監(jiān)測治療效果、尋找殘留癌細(xì)胞；（3）液體活檢與組織檢測經(jīng)常結(jié)果不一致，因此陰性液體活檢結(jié)果應(yīng)與腫瘤組織基因分型對(duì)比確認(rèn)。文章強(qiáng)調(diào)，ctDNA檢測結(jié)果必須與其他信息結(jié)合，才能為患者提供選擇。

       四、結(jié)語

       液體活檢是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的新技術(shù)，隨著研究的不斷深入，越來越多的研究成果將有望實(shí)現(xiàn)成果轉(zhuǎn)化，液體活檢將成為腫瘤診斷的重要技術(shù)手段。液體活檢要廣泛進(jìn)入臨床應(yīng)用也面臨眾多挑戰(zhàn)，不僅需要檢測技術(shù)靈敏度和特異性的提升、臨床研究的廣泛積累，還需要建立相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)、建設(shè)規(guī)范的監(jiān)管體系。(生物谷Bioon.com）