CAR-T療法經(jīng)歷磨難與挫折的傳奇故事（上）

       細胞療法

       那還是在1968年，Steven Rosenberg覺得他遇到了一個極其罕見的病例。

       Rosenberg當時還是West Roxbury VA Hospital的一名住院醫(yī)。病人的右上腹疼痛難忍，Rosenberg經(jīng)過檢查之后發(fā)現(xiàn)他患有急性膽囊炎。沒什么嚴重的吧，他這樣想，進行膽囊切除術(shù)就可以了。

       但在手術(shù)的時候，他發(fā)現(xiàn)病人的腹部有一道很長的手術(shù)疤痕。Rosenberg問他以前是不是接受過大型手術(shù)。“以前得過癌癥，”病人淡淡的說：“那還是很多年前的事情了。”

       Rosenberg調(diào)出了他之前的病歷，發(fā)現(xiàn)他12年前曾因患有消化道癌癥在這家醫(yī)院進行過手術(shù)，而且手術(shù)時癌癥就已經(jīng)轉(zhuǎn)移到肝 臟上。病歷中寫道，醫(yī)生雖然能夠?qū)⒁恍┐蟮哪[瘤切除，但對小的轉(zhuǎn)移灶卻無能為力。當時醫(yī)生大概是覺得病人的生存期已經(jīng)不會很長了，因此建議病人出院回家，享受生命的最后時光。

       然而讓Rosenberg意外的是，當他翻開病歷的下一頁，他發(fā)現(xiàn)這位病人在三個月后再一次來到了這家醫(yī)院就診，接下來的一次是六個月之后。病歷中寫著，一年以后這位病人已經(jīng)能重返工作崗位了。

       Rosenberg覺得他對此只有兩種解釋。一是醫(yī)生診斷錯誤，也就是說這位病人并不是癌癥患者，雖然存在這種可能性，但是概率并不高。而第二種可能是病人的癌癥經(jīng)歷了自發(fā)緩解過程而痊愈了。

       但這種情況發(fā)生的概率更低，因為直到Rosenberg遇到這位病人之前，醫(yī)學文獻中僅僅報道過四位這樣類型的患者。每年罹患癌癥的人何止千千萬，能夠自發(fā)緩解的人，大概只有其中的十萬分之一。

       Rosenberg檢查了病人的原始病理報告以及組織樣本，排除了第一種可能。唯一的解釋只能是病人經(jīng)歷了自發(fā)緩解過程。但在當時來說，這確實算得上是非常罕見的事情了。Rosenberg當時還只是一名住院醫(yī)，對他來說遇見這樣的病人毫無疑問是一種巨大的沖擊：這好像是魔法一樣，他曾這樣說道。

       為了讓這一魔法能夠再次重現(xiàn)，Rosenberg進行了一項聽起來很簡單的操作。他當時懷疑病人的血液中存在某種能夠抵抗癌癥的因子，而當時醫(yī)院恰好還有一位患有相同癌癥的病人與那位自發(fā)緩解的病人血型相同，因此Rosenberg在征得上級同意之后，將那位病情自發(fā)緩解的病人的部分血液輸入到了這位患者的體內(nèi)。

       結(jié)果可想而知，奇跡并沒有發(fā)生。接受輸血的病人疾病很快進展，不久之后便去世了。盡管沒能獲得成功，但Rosenberg卻變得十分著迷于癌癥以及免疫學。為了更加深入地進行研究，Rosenberg暫停了當時的外科手術(shù)培訓，去哈佛待了一年系統(tǒng)地學習免疫學知識。

       Rosenberg出生在一個傳統(tǒng)的猶太人移民家庭里。他的父母歷經(jīng)險阻從波蘭逃到了紐約，戰(zhàn)爭結(jié)束的時候，Rosenberg父母的大部分親人早已在大屠殺中喪生。那時的Rosenberg才六歲，一張張的明信片從歐洲寄到紐約，一次又一次地通知他們某位親人已經(jīng)在布痕瓦爾德或奧斯維辛的屠殺中喪生。

       這大概就是人世間的惡了吧?；蛟S是因為太小的年紀就經(jīng)歷過人性的陰暗面，Rosenberg從小就已經(jīng)很清楚將來要做什么：成為一名醫(yī)生，拯救患者的性命，而不是去害人。

       Rosenberg一直是一個工作狂，在他還年輕的時候，他曾想過跟當時還是女朋友的Alice O’Connell分手，因為他覺得戀愛會分散他進行科研的精力。

       “我很喜歡夜晚，”Rosenberg在1992年出版的一本書The Transformed Cell中這樣寫道。他還能回憶起年輕時深夜在實驗室工作的喜悅，喝著在加熱器上已經(jīng)熱了幾個小時的早已煮的粘稠的咖啡，迎著早晨的太陽走出實驗室，大概這世上再找不到能與之媲美的滿足感了吧。

       Steven Rosenberg

       67號病人

       Rosenberg剛到NCI的時候，人們對于抗腫瘤免疫反應的了解還極為有限。十八世紀末十九世紀初，紐約的William Coley醫(yī)生曾使用Coley toxin來激活病人的免疫系統(tǒng)，以此來治療癌癥 (見：腫瘤免疫療法的誕生)。但由于療效難以重復，而且制備過程復雜，在化療以及放射療法出現(xiàn)之后Coley toxin就逐漸淡出了人們是視野。

       其實在Rosenberg剛參加工作的七十年代，依然有很多人不相信人體內(nèi)的免疫反應能夠?qū)鼓[瘤。然而Rosenberg卻一直堅信細胞免疫療法的潛力。那時Rosenberg也做過很多現(xiàn)在看來很蠢的研究，比如將豬的淋巴細胞輸入到人的體內(nèi)。

       因為當時已經(jīng)有研究表明，將某些腫瘤抗原注射到兔子和豬的體內(nèi)之后能夠引發(fā)動物的免疫反應。Rosenberg認為既然動物體內(nèi)能夠存在對抗腫瘤細胞抗原的免疫反應，那么動物血液中就有可能存在一些能夠?qū)鼓[瘤的物質(zhì)。但與上一次相同，這一次的嘗試依然沒有成功。

       1976年，Robert Gallo實驗室發(fā)現(xiàn)IL-2能夠刺激T細胞的增殖 (見：抗擊艾滋病三十載：挫折、勇敢、堅韌與愛（一）)。Rosenberg希望能夠?qū)⑦@項發(fā)現(xiàn)應用到癌癥的治療上。于是他開始嘗試將IL-2加入到小鼠T細胞的培養(yǎng)基中，在五天之后，T細胞數(shù)量增長到了之前的30倍。

       IL-2是一個極好的研究工具。而Rosenberg當時也恰好需要這一工具，因為他的下一個免疫療法的方案是提取病人體內(nèi)的T細胞，然后在體外擴增之后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。

       Rosenberg認為，在所有從外周血提取的T細胞中，總有那么幾個細胞能夠識別腫瘤細胞。如果能夠擴增這類細胞的話，將有可能有效的攻擊腫瘤細胞。

       其實Rosenberg和同事在之前的實驗中就證實了，將腫瘤組織與免疫細胞共培養(yǎng)之后再將這些免疫細胞暴露于其他腫瘤組織之后，這些細胞能夠在體外殺滅腫瘤細胞。而且他們同時也發(fā)現(xiàn)，將IL-2注射至小鼠體內(nèi)之后能夠縮小小鼠的腫瘤。

       但是回輸使用IL-2培養(yǎng)過的T細胞，以及直接使用IL-2這兩種策略都沒能取得成功。而且更糟糕的是，Rosenberg發(fā)現(xiàn)IL-2的**非常大，能夠把每位接受治療的病人送進ICU。

       盡管如此Rosenberg依然沒有放棄，他開始嘗試使用這兩種治療手段的組合方案，也就是向病人體內(nèi)回輸體外培養(yǎng)的T細胞，并同時使用IL-2。

       從1980年到1984年，Rosenberg嘗試了太多種治療方法，然而他在之前66位病人身上使用的方案都失敗了。但在1984年他遇到了第67位病人Linda Taylor，一位患有黑色素瘤的海軍軍官。

       Taylor是Rosenberg第一位接受這種組合療法的病人，而她卻被成功的治愈了。Taylor到現(xiàn)在依然還活著。Taylor以及其他的一些人的成功治療，使Rosenberg以及IL-2療法登上了各大新聞的頭條，而他NCI的一些同事也開始稱呼他為Stevie Wonder。

       之后Rosenberg將數(shù)據(jù)發(fā)表 [1]。但后來人們卻發(fā)現(xiàn)該療法的作用其實沒那么大，因為該療法只能夠?qū)苌僖徊糠值暮谏亓鲆约澳I癌患者起效。

       在這之后Rosenberg的實驗室開始嘗試從手術(shù)切除的腫瘤中提取其中浸潤的淋巴細胞 (這類細胞被稱為tumor-infiltrating lymphocytes)，并嘗試在體外擴增后回輸?shù)讲∪说捏w內(nèi)，并同時使用IL-2進行治療。

       而除了療效的研究，當時Rosenberg實驗室還在進行一項TIL的基礎研究：提高TIL細胞的體內(nèi)存活時間，而這個任務也落在了Patrick Hwu的身上。

       飛馳的CAR

       Patrick Hwu 在1989年加入了Rosenberg的實驗室。他當時的第一項工作就是研究TIL細胞的存活時間。為了標記回輸至病人體內(nèi)的T細胞，Hwu將編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因?qū)氲搅薚細胞的基因組。

       該基因所表達的酶能夠保護T細胞不受新霉素的**作用影響。之后將細胞回輸至病人或小鼠體內(nèi)。幾周之后再從體內(nèi)提取T細胞，并向培養(yǎng)基中添加新霉素，之后再檢測存活細胞的數(shù)量。

       Hwu這項研究的結(jié)論很讓人意外，因為他發(fā)現(xiàn)這些回輸?shù)腡細胞在體內(nèi)只能存活大約三周的時間。人體內(nèi)的一些T細胞能夠存活長達數(shù)年的時間，而這些回輸?shù)腡細胞卻只能存活三周的時間，這大概也能部分解釋為何TIL療法的療效不佳。

       但Hwu和同事認為他們或許能夠提高T細胞在體內(nèi)的生存時間，這一靈感其實來源于骨髓移植。骨髓移植之前通常會使用氟達拉濱/環(huán)磷酰胺等清髓化療方案對病人進行清髓預處理，以摧毀病人的免疫系統(tǒng)。以使之后輸入的免疫細胞就能夠有足夠的生存空間。

       雖然這種方式應用于TIL療法理論上來講是可行的，但對病人來說也很危險。Hwu的同事基本都是外科醫(yī)生，只有Hwu一人是之前給病人使用過化療藥物的腫瘤學家。雖然他自己心里也很害怕病人出現(xiàn)問題，但從某種意義上來說，為了提高TIL的療效他必須進行這種嘗試。

       但是讓他們意外的是，病人對氟達拉濱/環(huán)磷酰胺的耐受性并不差。而且他們發(fā)現(xiàn)進行清髓化療之后再使用IL-2會使IL-2的**下降，并使部分病人的病情好轉(zhuǎn)。

       雖然這種方式取得了一定的成功，但到此時該療法治療黑色素瘤之外的其他類型腫瘤的療效依然非常差。為何這一療法不能應用于其他類型的腫瘤呢？Hwu決定采用其他手段來解決這一問題，比如將TNF基因?qū)氲絋IL細胞中，使這些細胞在遷移至腫瘤位點之后再分泌TNF。

       但是這個研究項目進展很緩慢。其實Hwu所進行的這些TIL研究項目的難度都很高，因為Hwu當時發(fā)現(xiàn)TIL細胞的體外培養(yǎng)非常困難，而且TIL并不像其他一些類型的細胞那樣容易表達外來基因，當時能夠提高轉(zhuǎn)染成功率的技術(shù)種類也非常有限。

       Hwu的這個研究項目最終也沒取得成功，但他在TIL培養(yǎng)以及將外源基因?qū)隩細胞的經(jīng)驗，卻對Zelig Eshhar當時進行的一項研究產(chǎn)生了很大的影響。

       左：Patrick Hwu 右：Zelig Eshhar

       Zelig Eshhar 出生于以色列一個叫Rehovot的小鎮(zhèn)。Eshhar的博士以及博士后研究一直專注于免疫學領(lǐng)域的研究。他整天腦子里想的全是免疫，T細胞結(jié)構(gòu)，抗體的功能。而有一天，Eshhar的腦子里出現(xiàn)了一個很奇怪的想法：T-body。

       Eshhar在研究T細胞受體(T cellreceptor, TCR)的結(jié)構(gòu)的時候，他覺得TCR與抗體的結(jié)構(gòu)和功能存在很多類似的地方?？贵w是由B細胞(漿細胞)制造的，而TCR則存在于T細胞上。從結(jié)構(gòu)上講，TCR由alfa和beta鏈組成，抗體由重鏈以及輕鏈組成，兩者都包含恒定區(qū)以及可變區(qū)。而從功能上講，TCR以及抗體都有抗原識別的功能。而且表達抗體和TCR的基因?qū)儆谕粋€基因家族。

       但TCR與抗體識別抗原的方式存在明顯差異，因為抗體能夠識別抗原的固有形態(tài)，而且具有較高的親和性，但TCR只能夠識別MHC遞呈的抗原片段。

       如果將TCR的可變區(qū)替換為抗體的可變區(qū)會產(chǎn)生什么后果呢 (TCR-AntiBODY, T-body)？是否會將抗體的抗原特異性轉(zhuǎn)移到T細胞上呢？

       該嵌合結(jié)構(gòu)的抗原受體也同時包含TCR細胞外的恒定區(qū)，以及跨膜區(qū)和TCR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)，因此該受體也應該能夠誘導T細胞增殖，介導白介素生成以及使靶細胞裂解。

       Eshhar也證實了這一想法的可行性。Eshhar實驗室將TNP (2，4，6-三硝基苯) 抗體的可變區(qū)移植到了TCR的恒定區(qū)上，并證明了該嵌合抗原受體 (chimeric antigen receptor, CAR) 受體具有類似該抗體的特異性，并能夠以非MHC限制性的方式結(jié)合TNP抗原，并介導白介素生成和靶細胞裂解 [2]。

       Eshhar這項研究的目的只是想驗證是否能夠改變T細胞受體的抗原特異性，并介導其相應的細胞殺傷作用。而將其用于腫瘤治療領(lǐng)域的設想其實是后來才有的想法。因為當時利用單克隆抗體治療癌癥的研究已經(jīng)比較多了，而Eshhar的技術(shù)理論上能夠克服TCR識別腫瘤抗原的缺陷，將TCR的可變區(qū)替換為靶向腫瘤抗原的抗體可變區(qū)。

       而如果將該技術(shù)應用于疾病治療領(lǐng)域的話，Eshhar還需要對以上技術(shù)進行改進。因為他之前使用的永生化的細胞或雜交瘤細胞并不能直接應用于疾病的治療。

       但Eshhar在將嵌合基因?qū)氲皆鶷細胞的過程中卻遇到了困難。而Hwu對Eshhar遇到的困難一點也不感到意外，因為淋巴細胞本來就很難表達外源基因，而Hwu之前導入TNF基因的經(jīng)驗卻給了他很多經(jīng)驗。

       為了能夠在原代T細胞中穩(wěn)定的表達嵌合抗原受體基因，Eshhar決定與Hwu所在的實驗室合作。他們使用了來源于抗體的單鏈抗體片段(single-chain variable fragment, scFv)來解決嵌合抗原表達穩(wěn)定性的問題。

       而先前的實驗也證明了scFv與天然Fab片段的結(jié)合活性與特異性類似。而且他們使用了Fc受體的γ亞基來轉(zhuǎn)導抗原結(jié)合信號，(除此之外，1991年的時候Arthur Weiss實驗室證明了包含CD8, and the CD3ζ的CAR也足以激活T細胞)。

       Hwu等人構(gòu)建了作用于三種不同靶標的嵌合抗原受體(chimeric antigenreceptor, CAR)，一種是靶向乳腺癌細胞，一種是結(jié)腸癌，一種是卵巢癌。然后他們將這些系統(tǒng)導入到靶向黑色素瘤的TIL中。最后他們也證明了來源于MOv18抗體的CAR-T細胞能夠有效裂解相應的卵巢癌細胞。

       1993年，Hwu以及Eshhar等人將該數(shù)據(jù)整理成論文發(fā)表 [3]。這篇文章也成了CAR-T領(lǐng)域的里程碑式的文章。

       但在接下來的十年里，CAR-T療法卻經(jīng)歷了許多的磨難與挫折。

       上世紀九十年代，在Rosenberg實驗室所在街道的另一側(cè)，位于貝塞斯達的海軍醫(yī)學研究所里，Carl June同樣也在研究CAR-T。

    （未完待續(xù)）