Science特刊：一文讀懂CAR-T細(xì)胞療法進(jìn)展

       CAR-T細(xì)胞療法屬于過繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移（adoptive T-cell transfer，ACT）的一種，這是輸血醫(yī)學(xué)的一個新領(lǐng)域，涉及淋巴細(xì)胞回輸以實現(xiàn)抗腫瘤，抗病毒或抗炎作用。該領(lǐng)域從臨床前研究到臨床應(yīng)用一直得到快速發(fā)展，去年我們見證了兩款CAR-T細(xì)胞療法的上市，用來治療白血病和淋巴瘤。作為第一款上市的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品Kymriah的主要研發(fā)人員，賓夕法尼亞大學(xué)的Carl June教授等人在最新的《科學(xué)》綜述中，描述了目前CAR-T療法要進(jìn)入主流腫瘤學(xué)領(lǐng)域面臨的機遇和挑戰(zhàn)。

       ▲賓夕法尼亞大學(xué)Carl H June博士（圖片來源：賓夕法尼亞大學(xué)）

       1、TCR-T和CAR-T

       目前，ACT癌癥療法主要有三種類型：腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)、T細(xì)胞受體（TCR）T細(xì)胞和嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞。TCR-T或CAR-T細(xì)胞是通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)改造外周血T淋巴細(xì)胞而生成，CAR-T已經(jīng)有產(chǎn)品獲得FDA批準(zhǔn)。TIL治療的原理在多個臨床試驗中得以證實，顯示出誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的持久完全反應(yīng)，其能夠靶向黑色素瘤中的新抗原。針對這些不同形式的ACT，很多制藥和生物技術(shù)公司正在進(jìn)行研發(fā)和商業(yè)化。

       TCR由在T細(xì)胞表面與CD3復(fù)合物非共價結(jié)合的a-和β-鏈組成。第一種進(jìn)入臨床的TCR-T細(xì)胞癌癥免疫療法針對的適應(yīng)癥是轉(zhuǎn)移性黑素瘤，使用TCR結(jié)合來自黑素細(xì)胞分化抗原的人淋巴細(xì)胞抗原A2(HLA-A2)肽。

       隨后，更高親和力的TCR被開發(fā)出來，針對MART-1表位，通過降低MART-1表達(dá)來增強對癌細(xì)胞的識別。雖然這樣獲得了更高的緩解率，但會靶向表達(dá)在皮膚，眼睛和耳蝸的正常黑色素細(xì)胞。臨床中超過一半的患者出現(xiàn)脫靶效應(yīng)（on-target/off-tumor）**，提示靶向共同抗原會使得有效性和**之間往往只是差之毫厘。另外，靶向腫瘤睪丸抗原MAGE-A3的TCRs產(chǎn)生致死性神經(jīng)**和心臟**，也對TCR的研發(fā)帶來新的挑戰(zhàn)。

       然而，用表達(dá)對HLA-A2限制性肽特異性的TCR-T細(xì)胞靶向腫瘤睪丸抗原NY-ESO-1，獲得臨床有效的證據(jù)，而且沒有顯著的**。目前，工程化的NY-ESO-1 T細(xì)胞正在進(jìn)行晚期臨床試驗 (NCT01343043)，或許針對特定腫瘤新抗原的TCR會比靶向腫瘤共有抗原更安全。這一點還需要臨床試驗進(jìn)一步證實。

       ▲TCR-T和CAR-T細(xì)胞比較（圖片來源：《科學(xué)》）

       相比之下，CAR結(jié)合了抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（最常見的是由抗體可變結(jié)構(gòu)域衍生的單鏈可變片段（scFv）），TCR?鏈的信號結(jié)構(gòu)域，以及受體（如CD28，OX40和CD137）的共刺激結(jié)構(gòu)域。CAR克服了工程化TCR的某些局限性，例如需要MHC表達(dá)，MHC特性和共刺激信號。由Kuwana和Eshhar領(lǐng)導(dǎo)的小組首次表明了，這些類型的合成受體分子能夠使T細(xì)胞識別MHC非依賴性靶標(biāo)。與MHC限制無關(guān)的CAR識別，使CAR-T細(xì)胞具有顯著的抗腫瘤優(yōu)勢，因為腫瘤免疫逃逸的主要機制之一就是腫瘤細(xì)胞MHC相關(guān)抗原提呈的丟失。目前CAR-T細(xì)胞的一個局限性是它們需要靶向腫瘤細(xì)胞表面上的抗原。

       ▲TCR-T和CAR-T細(xì)胞的構(gòu)成（圖片來源：《科學(xué)》）

       2、在B細(xì)胞血液癌癥上大獲成功

       事實上，使用第一代CAR-T細(xì)胞療法治療多種癌癥的臨床試驗結(jié)果不盡如人意。直到2011年，靶向CD19和編碼共刺激區(qū)的第二代CAR-T細(xì)胞才成為癌癥工程化T細(xì)胞治療的主要范式。CD19的幾個主要的特征使它成為了近乎理想的治療靶點：在B細(xì)胞癌癥中高表達(dá)，是人類正常B細(xì)胞發(fā)育所必需，而且不在B細(xì)胞譜系之外表達(dá)。

       大多數(shù)復(fù)發(fā)性白血病患者在CD19特異性CAR-T細(xì)胞治療后獲得完全緩解。但出現(xiàn)了兩種形式的抗性。在急性白血病患者中，CD19抗原表位的缺失是腫瘤逃逸的主要機制。在針對青少年和小兒急性白血病患者的臨床試驗中，CD19表達(dá)陰性的患者復(fù)發(fā)率為28％。在慢性淋巴性白血病(CLL)中，尚無報道發(fā)現(xiàn)CD19缺失產(chǎn)生耐藥，CLL的耐藥性可能是由于細(xì)胞輸注后CAR-T細(xì)胞不能增殖。表2列出了CAR-T細(xì)胞療法在臨床治療中需要克服的幾個重要挑戰(zhàn)。

       ▲CAR-T細(xì)胞療法面臨的臨床挑戰(zhàn)和解決策略（圖片來源：《科學(xué)》）

       3、超越B細(xì)胞

       目前，CAR-T技術(shù)已被證明除了靶向CD19之外還有更廣泛的應(yīng)用，針對靶點BCMA和CD22的CAR-T細(xì)胞在治療多發(fā)性骨髓瘤和急性淋巴性白血病的早期臨床試驗中顯示出抗腫瘤療效。然而，BCMA和CD22與CD19一樣，高度局限于在B細(xì)胞系上表達(dá)，因此只對特定組織有效。靶向?qū)嶓w瘤相關(guān)的抗原方面仍然沒有太多進(jìn)展。

       ERBB2/HER2是腫瘤中過度表達(dá)的一種酪氨酸激酶受體，是許多抗體和ADC藥物的有效靶標(biāo)。但是，靶向ERBB2/HER2的CAR-T細(xì)胞治療第一例患者時產(chǎn)生了致命的**。跟多研究發(fā)現(xiàn)**是由于低密度表達(dá)ERBB2的肺上皮細(xì)胞也被CAR-T細(xì)胞識別和攻擊，引發(fā)肺功能衰竭和大量細(xì)胞因子釋放。因此，研究者采用更低劑量、更低親和力的CAR- T細(xì)胞治療肉瘤患者，結(jié)果顯示是安全的，但臨床效果有限。

       另外，以碳酸酐酶IX(CAIX)抗原作為靶點的一代CAR-T細(xì)胞療法在治療腎細(xì)胞癌的1期臨床試驗中也意外產(chǎn)生肝**，原因是CAIX抗原在正常膽道上皮細(xì)胞也有低密度表達(dá)，但這在臨床前研究中沒有發(fā)現(xiàn)。以CEACAM5作為靶點的CAR-T細(xì)胞療法在臨床試驗中，出現(xiàn)延遲的呼吸**，且與T細(xì)胞峰值擴展一致，表明癌癥相關(guān)抗原潛在的on-target/off-tumor**。

       靶向與實體瘤相關(guān)的其他共有抗原，如間皮素、癌胚抗原和GD2神經(jīng)節(jié)苷脂的CAR-T療法在臨床試驗中未發(fā)現(xiàn)明顯的**；然而，這些試驗中觀察到的抗腫瘤活性也很弱。而具有增強的抗腫瘤活性的GD2特異性CAR-T細(xì)胞已經(jīng)在臨床前模型中發(fā)現(xiàn)會誘導(dǎo)致命的神經(jīng)**。

       另外，腫瘤微環(huán)境是ACT療法成功應(yīng)用的一大障礙，特別是在實體瘤中。包括免疫檢查點(如PD-L1表達(dá))、腫瘤代謝環(huán)境的改變(如缺氧或吲哚胺-1-氧化酶和精氨酸酶)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及抑制性骨髓細(xì)胞。在細(xì)胞治療的過程中，這些免疫和代謝檢查點在腫瘤中的表達(dá)都會升高，表現(xiàn)出適應(yīng)性耐藥。

       目前，PD-1/PD-L1單抗與CD19 CAR-T細(xì)胞療法組合的臨床試驗正在進(jìn)行中(例如NCT02926833，NCT02650999和NCT02706405)。除了與檢查點抑制劑的組合以外，研究人員還在研發(fā)阻斷這些抑制通路的替代療法，例如開關(guān)受體或基因編輯。

       4、CAR-T療法的**

       接受ACT治療后，T細(xì)胞活化會產(chǎn)生免疫刺激和炎癥反應(yīng)。目前，靶向CD19、BCMA和CD22的CAR-T細(xì)胞療法都出現(xiàn)過嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)，比用TIL和TCR治療出現(xiàn)的流感樣綜合征更加嚴(yán)重。CAR-T細(xì)胞療法帶來的CRS與腫瘤負(fù)荷相關(guān)。

       此外，靶向CD19和BCMA的CAR-T細(xì)胞曾報道過意外神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。其中CD19 CAR-T細(xì)胞療法產(chǎn)生的神經(jīng)**大部分可逆，但目前還不清楚腦水腫是CRS引起的還是另外有作用機制。目前，研究人員對于T細(xì)胞免疫療法導(dǎo)致的CRS和腦水腫的機制仍不清楚。

       ▲CAR-T細(xì)胞療法的副作用：細(xì)胞因子釋放綜合癥和神經(jīng)**（圖片來源：《科學(xué)》）

       5、通用型CAR-T療法

       盡管ACT療法屬于異基因骨髓移植，但由于MHC的原因，ACT療法目前仍集中在自體T細(xì)胞。如果可以消除MHC障礙，就能夠?qū)崿F(xiàn)同種異體T細(xì)胞治療。與自體T細(xì)胞療法相比，通用型CAR-T細(xì)胞來源于健康供體，有可能克服許多與癌癥治療相關(guān)的免疫缺陷；另外，通用型CAR-T細(xì)胞療法的制造工藝更加簡化，有望實現(xiàn)更快速、更便宜的“現(xiàn)成(off the shelf)”細(xì)胞療法產(chǎn)品。

       最近，一項采用TALEN（轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶）基因工程化改造的細(xì)胞在兩名患者身上進(jìn)行了試驗，結(jié)果證明了現(xiàn)成的CD19 CAR-T細(xì)胞療法的可行性。但基因通用型CAR-T細(xì)胞的移植在兩個受試者中都受到限制，減弱了療法的有效性。重要的是，受試者1的所有MHC I等位基因發(fā)生錯配，導(dǎo)致了移植物抗宿主病。這意味著完全的基因編輯對于該療法的成功至關(guān)重要。另外，自然殺傷(NK)細(xì)胞對MHC I類缺陷細(xì)胞的識別也可能限制了移植。防止NK細(xì)胞溶解通用型CAR-T細(xì)胞的一種方法是插入HLA-E并刪除HLA-A，-B和-C，這樣可以阻止宿主T細(xì)胞殺死通用型CAR-T細(xì)胞。

       由于該領(lǐng)域的快速發(fā)展，通用型CAR-T細(xì)胞可能得到廣泛應(yīng)用。然而，問題是它到底能作為單藥療法還是（例如干細(xì)胞移植或自體CAR-T細(xì)胞治療的）輔助療法。

       6、基因編輯和多功能CARs

       有許多基因編輯工具，包括鋅指核酸酶（ZFNs），歸巢核酸內(nèi)切酶（meganucleases），TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶。這些技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于工程化T細(xì)胞研究。現(xiàn)在該領(lǐng)域的主要問題是源自細(xì)菌的Cas9的免疫原性是否會影響CRISPR-Cas9基因編輯的T細(xì)胞的藥物輸送。

       基因組編輯有可能用來解除CTLA-4和PD-1等免疫抑制信號，增強T細(xì)胞的功能，同時避免全面阻斷免疫檢查點分子帶來的相關(guān)**?；蚓庉嬕部梢杂糜谇贸齌細(xì)胞表達(dá)的CAR靶點的基因，使得靶向不適用于T細(xì)胞免疫療法的抗原成為可能。最近，研究者將CAR引入TCR基因座，可以在內(nèi)源性TCR啟動子的條件下控制受體表達(dá)，從而顯著增強CAR-T細(xì)胞功能。

       為了減少與ACT的自身反應(yīng)性免疫的潛在風(fēng)險，研究人員已經(jīng)開發(fā)了使基因工程T細(xì)胞誘導(dǎo)性死亡的合成分子系統(tǒng)，通常稱為“自殺開關(guān)”。最有名的方法是用促凋亡蛋白caspase-9與FKBP12（iCasp9）的結(jié)構(gòu)域融合。在引入二聚體小分子例如利米德凝膠時，iCasp9的FKBP12結(jié)構(gòu)域二聚化，使得T細(xì)胞經(jīng)歷快速凋亡性細(xì)胞死亡。在造血干細(xì)胞移植后的同種異體淋巴細(xì)胞輸注中評估了iCasp9方法的試驗，已經(jīng)證實了強大T細(xì)胞消除能力，避免移植物抗宿主病。

       7、CAR-T的推廣之路

       目前，全球有250多個關(guān)于CAR-T細(xì)胞的臨床試驗研究。其中，中國和美國是兩大熱門地區(qū)，歐洲、日本和南半球的臨床試驗數(shù)量要少得多。這與接受和投資新興療法的意愿，衛(wèi)生監(jiān)管政策以及社會差異都相關(guān)。

       ▲CAR-T細(xì)胞療法臨床試驗的全球分布（圖片來源：《科學(xué)》）

       血液癌癥患者，特別是CLL和多發(fā)性骨髓瘤患者接受有效、但不能治愈的療法帶來的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)也是一大挑戰(zhàn)。CLL是美國最常見的白血病形式，2000年約有100,000名患者，而且目前的療法都只能改善生存狀況，并不能治愈。因此給患者帶來了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。據(jù)估計，每名患者的終生治療費用為604,000美元，到2025年，美國的CLL的醫(yī)療費用估計超過50億美元/每年。

       CAR-T細(xì)胞治療可能比現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)療法更具成本效益。目前高度個體化的T細(xì)胞療法的工藝需要定制，由此帶來高成本。但隨著工藝的成熟，制造成本會有所下降。

       8、未來機會與挑戰(zhàn)

       治療白血病和淋巴瘤的CAR-T細(xì)胞療法的出現(xiàn)值得關(guān)注，有多個方面的原因。也許最重要的原因是，CAR-T是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的第一種獲得推廣的基因療法。

       目前，開發(fā)細(xì)胞療法的挑戰(zhàn)之一是缺乏可以評估這些復(fù)雜療法的安全性和有效性的臨床前模型，或者是對早期臨床研究中發(fā)現(xiàn)的安全問題的應(yīng)對措施。另外，在治療實體瘤方面仍然存在許多障礙。

       值得期待的是，由于工程化T細(xì)胞、基因編輯和細(xì)胞制造領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步，未來基于T細(xì)胞的療法有望擴大到其他細(xì)胞類型，如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和NK細(xì)胞；適應(yīng)癥也會超越癌癥，有望用于傳染性疾病、器官移植和自身免疫性疾病等各類疾病。

       參考資料：

       [1] CAR T cell immunotherapy for human cancer

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