新腦膜炎球菌結合**技術發(fā)展進展

       背景：在撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)，A型腦膜炎雙球菌是造成細菌性腦膜炎的主要原因。腦膜炎球菌是一種胞外多糖包被的病菌。針對該多糖產生的抗體可以起到的保護作用。純化多糖**對控制A型腦膜炎球菌引起的流行病僅具有較小成功率。而蛋白-多糖結合**對多種價態(tài)的病菌具有高效保護作用。方法：單價A型腦膜炎球菌多糖-破傷風類毒素結合**已被腦膜炎**項目（PATH和世界衛(wèi)生組織的合作關系）的科學家發(fā)明出來。結果：生物制品評價與研究中心的細菌多糖實驗室發(fā)明了一種高效結合方法。印度血清研究所進一步發(fā)展該方法，利用純化的A型多糖和載體蛋白破傷風類毒素生產現(xiàn)在應用的高效A型多糖結合**。結論：雖然多年來，腦膜炎球菌多糖**在非洲腦膜炎球菌帶預防腦膜炎球菌流行病作用有限。但我們合作開發(fā)的A型結合**是一種安全高效的**。

       腦膜炎球菌是流行性病原，是造成成人、兒童細菌性腦膜炎的重要原因。關于腦膜炎球菌疾病對公共衛(wèi)生的威脅程度隨著時間及區(qū)域變化會發(fā)生較大變化。但每當腦膜炎球菌疾病發(fā)生時，腦膜炎球菌的流行病潛力涉及特殊的公共衛(wèi)生安全。

       腦膜炎球菌基于化學成份及不同的胞外多糖被分為12種不同價態(tài)。幾乎所有的腦膜炎球菌疾病都是由A、B、C、X、Y和W型腦膜炎球菌造成的。不同價態(tài)的影響重要性隨地理區(qū)域發(fā)生變化。A型腦膜炎球菌在撒哈拉沙漠以南的非洲是最重要的腦膜炎疾病的因素，而在美國，一半的腦膜炎球菌疾病是由C、Y型引起的。在亞洲國家，80%的疾病由B型腦膜炎球菌引起。X型和W型在非洲造成較小或中等規(guī)模疾病爆發(fā)。

       人類是腦膜炎球菌唯一的自然宿主。5%-10%的成人是無癥狀腦膜炎球菌攜帶者。在引進A型結合**前，數(shù)據(jù)顯示撒哈拉沙漠以南非洲A型腦膜炎球菌攜帶率小于1%。

       A型腦膜炎球菌結合**的必要性

       許多的非洲流行疾病與A型腦膜炎球菌有關。在過去的20年里，蒙古、尼泊爾、印度均報道過A型流行病爆發(fā)，但相較于撒哈拉沙漠以南的非洲程度較小。非洲“腦膜炎帶”面積巨大，從西部的塞內加爾延伸到東部的埃塞俄比亞，有約4.5億人。非洲“腦膜炎帶”的概念是由Lapeyssonnie在1963年第一次提出。腦膜炎球菌流行病易發(fā)于炎熱、干燥、多灰的季節(jié)，一般是一月到五月，而雨季后立即停止。每年都會在多個國家集中發(fā)生流行病，而每8-12年會發(fā)生流行病大爆發(fā)。流行病的周期性反映了隨時間人口免疫性的巨大變化。

       在非洲主要流行病中，100-800人/每100000人（部分地區(qū)高達1%）是由A型腦膜炎球菌引起的。盡管投入了百萬劑量的A/C多糖**來應對流行病爆發(fā)，但還是存在高比例的爆發(fā)。A型腦膜炎球菌流行病爆發(fā)經常持續(xù)2個月以下，而相應措施需要菌種鑒定、尋找**、獲得資金用于**購買和運營費用。以上過程都需要時間，相應措施經常滯后甚至在流行病爆發(fā)結束后。

       在1996年-1997年，西非遭遇了有史以來的腦膜炎流行病爆發(fā)，18萬感染案例，2萬人死亡。從1998年到2010年，WHO報道有70萬新增急性腦膜炎病例[8]。其中受影響最嚴重的國家包括布基納法索、尼日利亞、乍得、埃塞爾比亞。在2002年，爆發(fā)于以上國家的案例占整個非洲案例的65%。在2009年，尼日利亞報道7萬A型腦膜炎感染案例。在2004年，不屬于腦膜炎球菌帶的剛果民主共和國報道了1.1萬急性腦膜炎案例，腦膜炎帶似乎正在擴大。

       腦膜炎球菌多糖和結合**

       腦膜炎多糖**類似于其他細菌多糖**，不能有效地刺激幼兒的免疫系統(tǒng)，對嬰兒無免疫原性。唯一例外的是A型腦膜炎球菌多糖因不太了解的原因在初次免疫時，6月齡的嬰兒產生免疫性。而在兩劑免疫計劃下，嬰幼兒可產生有效免疫。盡管如此，在使用了數(shù)以百萬劑量的A型腦膜炎球菌多糖**后，在非洲A型腦膜炎流行病還在持續(xù)爆發(fā)。

       發(fā)展和使用腦膜炎球菌多糖結合**已經被論述過，本文主要聚焦于A型腦膜炎球菌多糖結合**。

       在商品化生產b型流感嗜血桿菌結合**前，40年前，Beuvery和Jennings 、Lugowski等人進行了最初關于A型腦膜炎球菌結合**生產與優(yōu)化的研究。他們描述了兩種結合A型多糖和蛋白的方法。第一種方法利用高碘酸鹽氧化部分解聚了的多糖的醛基端?；罨蟮娜┗瓮ㄟ^還原胺化反應與存在于氰基硼氫化鈉環(huán)境下的載體蛋白的自由氨基段結合，大多數(shù)結合與賴氨酸處。該方法活性位點存在于多糖的特殊位點。第二種方法利用碳二亞胺共價連接高分子量的多糖羧酸基團和載體蛋白的賴氨酸。使用第二種方法時，活化結合位點比較隨機。從生化角度來講，特異性的活化結合位點相較于隨機的活化位點，對多糖抗原表位損害較小，因此更具吸引力。

       Beuvery 等人制備了A型結合**免疫小鼠。使用六碳間隔的方法比在pH11時使用溴化氰在多糖上結合氰酸酯基團的方法更具免疫原性。 好像高pH值會導致A型多糖o-乙?；膩G失。研究顯示o-乙酰基對于A型多糖的免疫原性至關重要[15]。 A型結合**可以刺激T細胞依賴免疫，隨后單獨的多糖免疫起到增強的作用。Beuvery 研究顯示C型多糖結合**中的游離多糖需要減少（約10%），但不需要消除。

       A型單價多糖結合**在非洲發(fā)展應用是因為：（1）流行病學顯示在撒哈拉沙漠以南，A型單價多糖結合**可以預防90%當?shù)丶膊『土餍行阅X膜炎球菌疾病。（2）相較于多價產品更廉價。

       因多糖結合**免疫反應更持久，因此嬰兒對其免疫反應更好。幾種腦膜炎球菌多糖結合**制備方式在相關文獻中被介紹。目前獲得許可的多糖結合**含有蛋白通過氨基酸共價結合修飾或活化后的多糖形成的蛋白-多糖雜交組合。蛋白部分可提供了T細胞抗原表位。這些T細胞抗原表位與輔助T細胞CD4相互作用，大大促進了抗體對多糖的反應。即使對嬰兒，多糖結合**引起的T細胞依賴性反應都會產生血清免疫球蛋白G（IgG）和記憶B細胞。相比于自然多糖，多糖結合**的免疫原性不依賴于結合多糖的分子大小，結合多糖或寡聚糖表現(xiàn)為相同的免疫原性。A型多糖結合**對于高免疫原性所需要的分子量要求還未清楚論證。

       A型多糖結合**在非洲的發(fā)展

       來自受影響的西非國家的公共衛(wèi)生官員表示當前需要時間去降低結合**的成本（在美國，0.5美元/劑）。但對于該價格，沒有制藥公司有興趣發(fā)展單價A型結合**用于撒哈拉沙漠以南地區(qū)。

       腦膜炎**項目（MVP）成立于2001年，旨在與發(fā)展中國家的制藥公司合作利用A型多糖結合**在非洲消滅流行性腦膜炎這一公共衛(wèi)生問題（印度血清研究所有限公司[SIIL]，浦那）。腦膜炎**項目工作人員選取了荷蘭Synco生物公司的**水平的A型多糖，SIIL來源的類毒素，和法國Aérial的熱穩(wěn)定配方；并選取了美國食品藥品監(jiān)督管理局生物制品評價研究中心細菌多糖實驗室發(fā)明的高效結合技術。在2004年到2006年，技術轉讓成功的實現(xiàn)了實驗室及中試水平。在2009年之前，腦膜炎**項目的目標是每年生產2500萬劑**，到2012年，增加到多于5000萬劑**。在SIIL，多糖的生產、純化、結合過程實現(xiàn)了放大，最終在新廠區(qū)實現(xiàn)了工業(yè)化生產。同時，在申報臨床材料前對于原材料、結合物、產品的分析評價方法進行了制定與充分驗證。最終論證認為在生產的全過程，材料穩(wěn)定。

       對于規(guī)模的放大，尤其是產品質量的穩(wěn)定，經過了充分論證。分析SIIL兩年的產品數(shù)據(jù)，顯示全過程產率、游離多糖水平、蛋白多糖比非常令人滿意，標志從實驗室水平的工藝放大的成功。因此該技術從實驗室規(guī)模到中試規(guī)模再到生產規(guī)模成功完成。

       A型多糖結合**生產與質量控制

       多糖化學連接蛋白時，多糖需要活化即化學修飾。當前主要的兩種多糖活化方法是高碘酸鹽氧化和氰基化作用。高碘酸鈉氧化二元醇（兩個相鄰的碳帶有羥基）成為醛（C=O），同時斷裂C-C鍵，使多糖糖環(huán)打開。對A型多糖而言，只有缺乏O-乙酰基的重復的3號碳可以被高碘酸鈉氧化，這樣可以起到保護A型多糖結合**。O-乙?；技兓疉型多糖的77%-85%，可以起到保護免疫原性的作用。

       對于大部分結合產物，在氰基硼氫化鈉存在下，活化的多糖的醛基會和蛋白的氨基結合形成穩(wěn)定的仲胺。多糖醛基與賴氨酸 ε-氨基的結合是一個緩慢的過程，經常僅能獲得較低的產率。新的方法被發(fā)明出來降低結合時間，提高結合產率。結合效率通過同時活化多糖和蛋白載體蛋白方法提高活化的A型多糖與破傷風類毒素（TT）或酰肼活化的破傷風類毒素（TT-H）在室溫條件下反應過夜（15-16小時）。相比于TT，多糖與TT-H結合可以獲得更高分子量的結合物。

       A型多糖-破傷風結合**被分裝成1-2mg、25mg、500mg規(guī)格，用于驗證結合方法的重復性和可測量性。如圖1，在酸性條件下，1-乙基-3（二甲氨基丙基）碳二亞胺條件下，TT的羧基被酰肼替代。A型多糖在無O-乙?；亩嗵翘嶤3-C4被高碘酸鈉部分氧化（圖1）。TT活度顯示每個TT分子50個酰肼基團，而活化的A型多糖100個重復單位/每醛基。使用高效凝膠過濾色譜分離，206nm波長檢測未活化、活化后的TT和多糖及多糖-TT結合物。顯示活化后的TT分子量大小與未活化前相當，保留時間在22 min，表明較少聚合產生（圖2）?；罨蟮亩嗵欠肿恿孔冃。@示部分降解。結合反應之后一個高分子量的峰出現(xiàn)，表明A型多糖-TT結合物產生（圖2）。使用TT-H相較于TT，會產生較多結合產物。理化分析在生產過程中的各個環(huán)節(jié)進行，并存在多種可選方案。Silveira等在研究使用TT-H法生產的C型腦膜炎多糖結合物時，使用核磁共振顯示在結合后，活化多糖醛基的消失。同時，也描述了用于表征腦膜炎球菌多糖結合物的物化方法，其中包括肼含量的測定。由于多糖上的多元醛結構和TT上多元酰肼結構，結合方法會產生高分子量的交聯(lián)結構。該方法還被用于C、W型多糖的結合，可實現(xiàn)50%的結合物產率。

       （圖1） （圖2）

       動物體A型多糖結合物免疫研究

       A型多糖-TT結合物通過S-400分子排阻色譜分離高分子量和低分子量的結合物。通過S-400分離柱，將結合物分離成4部分（16-20，21-25，26-30，31-35）去研究它們對小鼠的免疫原性。在注射小鼠3×1-μg多糖時，相較于游離多糖（≥為檢測結合物的質量和效能，研究了MA031221J在低劑量條件（0.1-μg多糖劑量）下的免疫原性和添加-400%多糖或TT的影響（圖4）。第一次注射2周后，天然多糖和0.1-μg的多糖結合物僅引起較少的抗體（≤200units/mL），而1-μg可以產生顯著的抗體水平（≥1000-3000units/mL）。在第二次或第三次接種后，天然多糖可表現(xiàn)免疫原性（≤1000units/mL），而0.1-μg和1-μg結合物可引起較高水平抗體（≥220000units/mL）。多糖或TT的存在(-400%)對0.1-μg和1-μg結合物劑量有較小影響。

       在I期人體臨床實驗前，多種GMP標準下，不同生產規(guī)模的A型多糖結合**在小鼠或兔子進行安全性和免疫原性研究。

       （圖3） （圖4）

       A型多糖-TT結合**

       A型多糖-TT結合**凍干保存，使用前溶解，肌肉注射。**溶解于包含0.01%硫柳汞和0.3 mg三價鋁離子（以磷酸鋁記）鹽溶液中，0.5-mL/劑，包含10μg A型多糖結合10-33μg TT，0.06 mg Trs。最近在免疫擴張項目，5-μg規(guī)格的**被WHO提前授權用于嬰幼兒免疫。

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