深度：T細胞受體療法治療實體瘤的機遇和挑戰(zhàn)

       TCR 與 CAR療法比較

       TCR和CAR療法都對患者自身的T淋巴細胞在體外進行改造，然后將它們注回患者體內(nèi)殺傷腫瘤的癌癥療法，但是它們識別抗原的機制截然不同。TCRs利用α和β肽鏈構(gòu)成的異元二聚體（heterodimer）來識別由主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）呈現(xiàn)在細胞表面的多肽片段。而CARs則利用能夠與特定抗原結(jié)合的抗體片段來識別腫瘤細胞表面的抗原。因為MHC分子能夠呈現(xiàn)從細胞表面和細胞內(nèi)蛋白中獲得的肽鏈，TCRs與CARs相比，能夠靶向更多種抗原。

       ▲因為MHC分子能夠呈現(xiàn)從細胞表面和細胞內(nèi)蛋白中獲得的肽鏈，TCRs與CARs相比，能夠靶向更多種抗原。（圖片來源：《Nature Biotechnology》）

       理論上講，在治療實體瘤方面TCRs與CARs相比有著明顯的優(yōu)勢。“CAR-T細胞治療實體瘤方面的問題是因為它們的靶點抗原都是細胞表面蛋白，”Adaptimmune公司的聯(lián)合創(chuàng)始人Bent Jakobsen博士說。“我不知道是不是存在對人類癌癥具有特異性的細胞表面蛋白，”約翰?霍普金斯大學(xué)（Johns Hopkins University）的免疫學(xué)家Jonathan Schneck博士說：“即便CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞的功能卓越，如果沒有合適的靶點我們也無法對實體瘤產(chǎn)生真正的影響。”

       而TCRs靶向的細胞內(nèi)蛋白具備腫瘤特異性。這些抗原包括由于腫瘤DNA的隨機突變造成的新抗原（neoantigen）和所謂的癌睪丸抗原（cancer testis antigens）。這些抗原通常只在某些腫瘤和生殖系組織（germline tissue）中表達，而生殖系組織不會表達MHC。

       而且，表達TCR的T細胞通常侵入腫瘤內(nèi)部的能力會強于CARs，而CARs通常會附著在腫瘤的外層而不向內(nèi)部滲透。這是因為CAR靶向的抗原可能在腫瘤表面有上千個拷貝，它們會在CARs滲透到腫瘤內(nèi)部之前就將它們都吸收了。而TCRs在最初碰到腫瘤時遇到的抗原可能少于50個拷貝，這讓CARs能夠進一步深入腫瘤內(nèi)部與抗原結(jié)合，從而保證更均衡的藥物分布。

       TCR療法的起步和挑戰(zhàn)

       TCR療法的概念其實早于CARs產(chǎn)生。1986年，在巴塞爾免疫研究所（Basel Institute for Immunology）工作的Michael Steinmetz博士第一次將一個T細胞的TCR基因轉(zhuǎn)移到另一個T細胞中，從而賦予第二個T細胞相同的抗原特異性。這是當(dāng)今TCR基因療法的祖先。上世紀(jì)末，在美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）的Steve Rosenberg博士和Phil Greenberg博士率領(lǐng)的研究團隊證明可以通過分離特定TCR賦予T細胞新的抗原特異性。2004年，Rosenberg博士的團隊啟動了第一個TCR基因療法的臨床試驗，接受治療的15名黑色素瘤患者中有兩位的腫瘤達到完全緩解。這些患者自身的T細胞在體外得到擴增，并且在細胞中表達了對MART-1抗原具有特異性的TCRs。

       ▲Steve Rosenberg博士（圖片來源：By Rhoda Baer (Photographer) [Public domain], via Wikimedia Commons）

       同時，克隆TCRs并且將它們整合到病毒載體中使它們在T細胞中有效表達的技術(shù)日漸完善。2008年以來，多個TCR生物技術(shù)公司開始出現(xiàn)。其中Adaptimmune公司在2008年脫離MediGene成為獨立公司，Kite Pharma在2009年成立并且隨后與NCI達成研究協(xié)議。Juno Therapeutics在2013年于西雅圖成立。Kite（如今是Gilead的子公司）和Juno（如今被Celgene收購）在開發(fā)TCR療法的同時也在開發(fā)CAR療法。目前至少有16個臨床試驗正在驗證TCR療法在治療實體瘤方面的療效。

       ▲目前至少有16個臨床試驗正在驗證TCR療法在治療實體瘤方面的療效。（圖片來源：《Nature Biotechnology》）

       但是在TCR療法的開發(fā)過程中也遭受過嚴(yán)重的挫折。2011年，在NCI進行的利用靶向癌睪丸抗原MAGE-A3的TCRs治療實體瘤的臨床試驗中，頭9位患者中有3位患者在接受治療后立即出現(xiàn)嚴(yán)重**狀態(tài)變化，其中兩位很快昏迷并且去世。與此同時，賓夕法尼亞大學(xué)（University of Pennsylvania）的Carl June教授的團隊也在使用Adaptimmune公司開發(fā)的靶向MAGE-A3的TCRs。頭兩位接受TCR療法的患者迅速出現(xiàn)心源性休克（cardiogenic shock），在一周內(nèi)去世。

       ▲Carl June教授（圖片來源：University of Pennsylvania官方網(wǎng)站）

       后續(xù)研究表明NCI 的MAGE-A3 TCR意外地能夠與在大腦中的相關(guān)多肽MAGE-A12相結(jié)合。而Adaptimmune公司的TCR能夠與心臟中的肌聯(lián)蛋白（titin）相結(jié)合。肌聯(lián)蛋白被MHC呈現(xiàn)的多肽與MAGE-A3非常相似。

       為了防止類似事件的發(fā)生，Adaptimmune公司完全更新了篩查TCR特異性的系統(tǒng)，讓研究人員能夠確定在整個多肽組（peptidome）中TCR能夠與那些多肽結(jié)合。這會大幅度提高TCR的安全性。雖然安全性一直是人們關(guān)心的問題，但是在最近的臨床試驗中檢驗的TCR療法都表現(xiàn)出可以接受的安全性。

       權(quán)衡利弊

       目前對TCR療法來說最關(guān)鍵的問題是選擇哪種與腫瘤相關(guān)的抗原作為靶點。它們可以被分為3大類：過度表達的自身抗原，癌睪丸抗原，和新抗原。每一種類別都有自己的優(yōu)劣，而Juno, Adaptimmune和Kite三家公司也選擇了不同的開發(fā)方向。

       Juno公司選擇的是過度表達的自身抗原。該公司將使用靶向WT1的TCR治療急性淋巴細胞白血病（acute myeloid leukemia），間皮瘤（mesothelioma）和肺癌，利用靶向間皮素（mesothelin）的TCR治療胰 腺癌的臨床試驗將在今年開始。WT1和間皮素雖然在有些正常組織中表達，但是在很多腫瘤中高度表達。在某些情況下，TCRs可以在攻擊腫瘤細胞的同時對正常細胞沒有反應(yīng)。因為有研究表明可以選擇或者改進TCRs，讓它們只識別在腫瘤表面高水平表達的抗原。表達這類TCRs的T細胞應(yīng)該可以安全地殺死腫瘤細胞。這一策略如果成功，意味著可能有上千種腫瘤過度表達的蛋白成為靶點。

       但是靶向這類抗原同時也存在著風(fēng)險，例如，WT1在包括心臟在內(nèi)的幾種關(guān)鍵組織中表達。間皮素在有些組織的間皮細胞中也有低水平的表達，其中包括氣管。所以這些療法有可能帶來對健康組織的**。

       因為這個原因，Adaptimmune公司基本上避免靶向過度表達的自身抗原。該公司選擇的是癌睪丸抗原，最初的靶點包括MAGE-A10、MAGE-A4、PRAME和NY-ESO-1。這些抗原的特點是它們在成人組織中幾乎不會被處理成為多肽鏈。癌睪丸抗原的劣勢一直是表達這些抗原的癌癥種類較少。因此在癌癥患者中篩選出適合這一療法的患者是一個非常昂貴和費時的過程。但是在特定的幾種腫瘤患者中，MAGE-A4和PRAME抗原的表達比例很高，因此在這些腫瘤種類中篩選患者是可行的。

       例如NY-ESO-1在滑膜肉瘤（synovial sarcoma）中出現(xiàn)的幾率高達70%，因此Adaptimmune公司募集這些患者進行了一項臨床1/2期試驗。在去年六月舉行的ASCO年會上該公司公布了其中一個患者群的試驗結(jié)果：60%的患者對TCR療法產(chǎn)生反應(yīng)，其中一名患者達到完全緩解。預(yù)計平均總存活期可以達到159周。

       新抗原：個體化醫(yī)療的可行性

       在Juno公司通過謹(jǐn)慎靶向自身抗原來治療常見癌癥，而Adaptimmune的TCR策略將療法安全性放在首位的同時，NCI的Rosenberg博士和他的團隊以及他們在Kite Pharma的合作伙伴嘗試在保證安全性的同時，提高可治療患者的數(shù)量。他們選擇的是個體化TCR療法的方向。為了達到這一目標(biāo)，他們靶向的是腫瘤中出現(xiàn)的新抗原，這些抗原由于腫瘤細胞的DNA突變產(chǎn)生。它的優(yōu)點是幾乎所有癌癥患者都會產(chǎn)生新抗原，而且這些新抗原都具備腫瘤特異性。“壞消息是由于每個患者產(chǎn)生的新抗原都不同，這意味著療法需要對每個患者進行個體化的優(yōu)化，生產(chǎn)工序?qū)⒆兊梅浅?fù)雜。”Rosenberg博士說。

       使用新抗原作為TCR的靶點首先需要發(fā)現(xiàn)這些新抗原，腫瘤細胞DNA上發(fā)生的突變只有少量能夠?qū)е滦驴乖漠a(chǎn)生，目前沒有很好的算法能夠從DNA序列的變化預(yù)測新抗原的產(chǎn)生。Rosenberg博士的團隊將攜帶患者腫瘤基因突變的DNA序列表達在樹突狀細胞中，然后檢測哪些序列能夠產(chǎn)生被MHC呈現(xiàn)的含有突變的多肽鏈。同時檢測從患者身上收集的T淋巴細胞能否對呈現(xiàn)的多肽鏈產(chǎn)生反應(yīng)。如果患者的淋巴細胞能夠產(chǎn)生反應(yīng)，這意味著一個新抗原被發(fā)現(xiàn)了。研究人員可以收集患者的T淋巴細胞并且富集對新抗原有反應(yīng)的淋巴細胞作為療法。

       利用這種方法，Rosenberg博士的團隊成功在一名膽管癌（cholangiocarcinoma）復(fù)發(fā)的患者身上發(fā)現(xiàn)一種新抗原，將針對這種新抗原的T淋巴細胞進行富集并且注入患者體內(nèi)導(dǎo)致患者在肺部和肝 臟的轉(zhuǎn)移瘤縮小并且反應(yīng)時間長達2.5年。他的研究團隊已經(jīng)在結(jié)腸癌、乳腺癌、膽管癌和宮頸癌患者身上獲得過成功。Rosenberg博士的團隊目前使用的是利用對新抗原反應(yīng)性進行富集的T淋巴細胞，可以預(yù)見的是下一步研究人員將嘗試針對新抗原的TCRs。TCRs的優(yōu)勢是它們可以通過人工設(shè)計產(chǎn)生非常高的親和力。

       但是這種個體化的TCR療法工序能否推廣和擴大化是一個有爭議的話題。使用目前的制造工藝，整個產(chǎn)生個體化TCR療法的過程要花費大半年的時間，在這期間患者的癌癥將繼續(xù)惡化。目前限制這一療法的兩大阻礙是TCR克隆和病毒載體的構(gòu)建和驗證。TCR克隆過程通常需要6~8周才能完成，而在良好生產(chǎn)規(guī)范（good manufacturing practice, GMP）狀態(tài)下構(gòu)建病毒載體并且對它進行安全性檢測需要花費6個月的時間和大約25萬美元。“目前這種方法無法進行擴大化生產(chǎn)，”Greenberg博士說：“成本實在太高了。”而且通常一個基因突變不會在所有腫瘤細胞中存在，于是你要對多個新抗原做同樣的事。腫瘤異質(zhì)性對所有TCR療法都是一個挑戰(zhàn)，但是靶向單個新抗原可能是一種事倍功半的做法。

       Rosenberg博士的團隊在使用機器人系統(tǒng)力圖用最少的細胞篩選更多基因突變，從而加快TCR的克隆過程。在構(gòu)建載體方面，病毒載體可能被睡美人轉(zhuǎn)座子（sleeping beauty transposon）系統(tǒng)或CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)取代。位于波士頓的Ziopharm公司的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已經(jīng)被證明可以將靶向新抗原的TCR成功轉(zhuǎn)移到T細胞中。這一系統(tǒng)已經(jīng)在幾項臨床試驗中使用。轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建和擴增都在質(zhì)粒DNA中完成，這將大幅度減少與病毒載體相關(guān)的花費和監(jiān)管負擔(dān)。

       雖然研究人員承認靶向新抗原的個體化TCR療法目前還不完善。“它還是太慢了，太貴了，”Rosenberg博士的長期合作者Nick Restifo博士說：“但是它正在變得更快和更便宜。”更多的生物公司也加大對這一領(lǐng)域的投入。位于麻省劍橋的Neon Therapeutics公司最近與瑞士巴塞爾（Basel）的CRISPR Therapeutics公司達成合作，共同開發(fā)基于新抗原的T細胞療法。“我從來沒有想過基于新抗原的TCR療法能夠獲得商業(yè)成功，”June博士說：“但是它將會發(fā)生。”

       打破腫瘤耐受的方法

       擁有迅速并且廉價的靶向新抗原的TCR系統(tǒng)本身并不足以治愈大多數(shù)轉(zhuǎn)移性癌癥。因為這些腫瘤通常會制造一個免疫耐受的環(huán)境，讓針對腫瘤的T細胞無法被正常激活。“最終我們需要的不單是靶向單個新抗原，而是同時帶來更廣泛的免疫反應(yīng)，”Jakobsen博士說：“這樣你才能打破對腫瘤的免疫耐受狀態(tài)。這是讓免疫系統(tǒng)重新獲得控制權(quán)的方法。”

       目前的免疫療法很少能夠達到這一目標(biāo)?，F(xiàn)有的TCR療法在縮小腫瘤和啟動免疫反應(yīng)方面能夠起到一些作用，但是關(guān)鍵是找到某些能夠激發(fā)對腫瘤的多克隆免疫反應(yīng)的方法。將TCRs與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用可以達到這一目標(biāo)，但是如PD-1阻斷劑一類的免疫檢查點抑制劑在攜帶高基因突變負擔(dān)的腫瘤中效果，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰 腺癌和前列腺癌中卻很少能夠起作用。

       其它方法包括在TCRs中引入共受體（co-receptor）。“基本上所有在CARs中做過的改進方法你都可以想像在TCRs中進行，”伊利諾伊大學(xué)（University of Illinois）的免疫學(xué)家David Kranz博士說。另外一種方法是將TCR細胞療法與激活干擾素基因的激動劑一起使用。

       而最明顯的激活多克隆腫瘤免疫反應(yīng)的方法是通過CD4 輔助性T細胞（helper T cells）。CD4細胞能夠增強抗原呈現(xiàn)并且通過多種機制加強CD8效應(yīng)T細胞的功能。比如CD4細胞可以分泌干擾素γ，它能夠?qū)е乱活惡投怣HC分子的表達并且在樹突狀細胞中提高抗原呈現(xiàn)機制中其它成份的表達。Kranz博士認為在CD4細胞中使用TCR將是下一個重要研究方向。

       “這是產(chǎn)生更多CD8和CD4細胞，讓它們識別除了你靶向的抗原以外的其它抗原的刺激方法，”Jakobsen博士說。癌癥免疫學(xué)家認為這種抗原表位擴展（epitope spreading）的效應(yīng)是消滅實體瘤的關(guān)鍵。

       CARs 和 TCRs 的未來

       一種能夠同時幫助CARs和TCRs療法的技術(shù)是Cell Design Labs公司的合成Notch受體（Synthetic Notch Receptor，SynNotch）技術(shù)。這種技術(shù)能夠在細胞中建立一個能夠感知組織特異性的SynNotch。它相當(dāng)于一個開關(guān)，讓表達在T細胞表面的TCRs或CARs只有在特定組織中才會被激活。SynNotch能夠幫助CARs克服在治療實體瘤方面的挑戰(zhàn)，那就是沒有足夠特異性的腫瘤抗原。

       June教授認為CAR和TCR療法最終都將對實體瘤產(chǎn)生作用。而且CARs和TCRs應(yīng)該合并成為組合療法，因為腫瘤對這兩種療法產(chǎn)生抗性的方法截然不同。腫瘤通過丟失MHC來逃避TCRs，而對CAR-T細胞的逃逸是通過丟失靶向抗原來完成。腫瘤細胞不太可能同時產(chǎn)生兩種抗性，因此CAR-TCR組合療法能夠消滅它們。“因為人類實體瘤的克隆復(fù)雜性，我認為只用一種細胞，一個CAR或者一個TCR就能成功是不現(xiàn)實的，”June博士說：“一旦你認可了使用細胞療法來治療患者，那么生產(chǎn)一個同時包括CAR和TCR的產(chǎn)品的成本并不會增加多少。”

       去年9月，葛蘭素史克（GlaxoSmithKline，GSK）公司斥資6100萬美元從Adaptimmune公司買入了一個TCR基因療法項目。這個信號表明大量涌入CARs的投資也惠及TCRs。不過在TCRs領(lǐng)域的一個明確的臨床成功將對這一領(lǐng)域的投入產(chǎn)生很大幫助。“現(xiàn)在很多公司都在等待看到概念驗證上的成功才會跟進，”Greenberg博士說。不過那些在TCR領(lǐng)域孤獨地工作了數(shù)十年的核心科學(xué)家們終于很高興地看到，這項技術(shù)成為治療癌癥的主流之一并且在經(jīng)歷爆炸性的發(fā)展。

       參考資料：

       [1] Driving T-cell immunotherapy to solid tumors

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