過去的理論又錯(cuò)了，長文報(bào)道CTLA-4抗體在腫瘤免疫治療中的新機(jī)制新模型

       這兩項(xiàng)研究表明，長久以來流行的抗CTLA-4抗體Ipilimumab在癌癥免疫治療中的免疫檢查點(diǎn)假說并不成立，即Ipilimumab并沒有通過阻斷CTLA-4/B7相互作用而發(fā)揮抗腫瘤效果，而清除Fc受體介導(dǎo)的高表達(dá)CTLA-4的腫瘤局部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則在有效的免疫治療中至關(guān)重要。作者利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型，模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯(lián)用造成的各個(gè)臟器的免疫副作用，并評(píng)估了其它抗CTLA-4抗體的安全性，闡明了失調(diào)的自身反應(yīng)性Treg及全身T細(xì)胞的活化是造成免疫副作用的根本原因。這些研究成果對(duì)今后研發(fā)新一代高效并且安全的抗CTLA-4抗體以及其它以CTLA-4為靶點(diǎn)的藥物有著深遠(yuǎn)的指導(dǎo)意義。

       近年來，隨著腫瘤免疫調(diào)控機(jī)制的逐漸清晰和基因改造技術(shù)的不斷提高，腫瘤免疫治療領(lǐng)域得到了空前發(fā)展。尤其是近幾年來，免疫檢查點(diǎn) （Immune Checkpoint）單抗藥物與嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞免疫治療的效果逐漸獲得認(rèn)可，癌癥免疫治療的概念也越來越深入人心。目前腫瘤免疫藥物治療的最主要方面是腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑，即通過抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，調(diào)動(dòng)自身免疫系統(tǒng)功能來消除腫瘤，當(dāng)前的研究主要集中在CTLA-4、PD-1和PD-L1三個(gè)分子上。

       CTLA-4分子高表達(dá)于調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）和激活的T淋巴細(xì)胞上。正常情況下，T淋巴細(xì)胞的活化需要兩條信號(hào)通路共同激活，其一是T細(xì)胞受體（TCR）與抗原呈遞細(xì)胞（APC）呈遞的MHC-抗原肽復(fù)合物相結(jié)合（信號(hào)1），其二是B7分子（B7-1或B7-2）與T細(xì)胞表面的共刺激分子CD28相結(jié)合（信號(hào)2）。T細(xì)胞活化后高表達(dá)的CTLA-4分子雖然與CD28具有高度同源性，但功能相反，即CTLA-4分子與B7分子結(jié)合后抑制T細(xì)胞的活化。

       2011年，美國FDA批準(zhǔn)首款抗CTLA-4抗體抑制劑Ipilimumab（商品名YERVOY?）用于黑色素瘤的治療，療效顯著。根據(jù)免疫檢查點(diǎn)阻斷的假說（Checkpoint Blockade Hypothesis），在外周淋巴器官，抗CTLA-4抗體如Ipilimumab是主要通過阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號(hào)通路【圖1】，從而促進(jìn)T細(xì)胞的激活而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而這一流行的關(guān)于Ipilimumab在癌癥免疫治療中發(fā)揮作用的主要假說并沒有得到嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

       圖1. T細(xì)胞的活化需要通過TCR/MHC（信號(hào)1）和CD28/B7（信號(hào)2）進(jìn)行共刺激。 抗原呈遞細(xì)胞（APC）上的B7分子（包括B7-1和B7-2）與T細(xì)胞上的CTLA-4的結(jié)合抑制T細(xì)胞功能。 抗CTLA-4抗體阻斷CTLA-4結(jié)合B7并阻止其對(duì)T細(xì)胞功能的抑制。

       雖然Ipilimumab可以阻斷錨定狀態(tài)的（Immobilized ）CTLA-4分子和游離的（Soluble ）B7分子的相互作用【圖2A】（J Immunol. 2003 Dec 1;171(11):6251-9.），但B7分子是膜表面表達(dá)的共刺激分子，因此以前的研究并不能證實(shí)Ipilimumab能夠有效阻斷在生理狀態(tài)下的CTLA-4和B7的相互作用。劉陽/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室的研究表明，當(dāng)B7分子被固定后（比如B7包被在ELISA板上時(shí)【圖2B】或者表達(dá)在細(xì)胞表面【圖2C】），Ipilimumab（包括臨床上使用的Ipilimumab以及按照已公布的抗體序列由不同公司合成的Ipilimumab）在體外并不能很好地阻斷細(xì)胞表面的CTLA-4/B7的相互作用【圖2D】，也不能有效地阻斷CTLA-4介導(dǎo)的B7分子的轉(zhuǎn)胞吞（Transendocytosis）作用【圖2E】。與此不同的是，劉陽/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室篩選出的另外一種抗CTLA-4的半人源化的抗體L3D10 （Blood. 2005 Feb 1;105(3):1114-20.和Blood. 2005 Nov 1;106(9):3127-33.），卻能非常顯著地阻斷各種形式的CTLA-4/B7的體外相互作用【圖2】。 此外，在human CTLA-4 knock-in的人源化小鼠和human CD34+ stem cells重組的NSG小鼠中，L3D10——而不是Ipilimumab——能夠顯著抑制human CTLA-4對(duì)脾 臟樹突狀細(xì)胞表面B7分子的轉(zhuǎn)胞吞下調(diào)【圖2F】，從而提供了在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的生理狀態(tài)下Ipilimumab不能有效阻斷CTLA-4/B7相互作用的證據(jù)。

       圖2. 當(dāng)B7分子被固定時(shí)，L3D10——而不是Ipilimumab——能夠在體外和體內(nèi)顯著阻斷CTLA-4/B7的相互作用。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）

       更重要的是，劉陽/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室的研究指出，阻斷CTLA-4/B7的相互作用，并沒有貢獻(xiàn)于抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果。這一論斷來自多個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)證據(jù)：

       1）在human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h，即CTLA4的兩個(gè)等位基因均來自human）的小鼠模型中，抗human CTLA-4的抗體L3D10能夠有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用；而在human CTLA-4半人源化（CTLA4h/m，即CTLA4的兩個(gè)等位基因一個(gè)來自human，一個(gè)來自mouse）的小鼠模型中，只能識(shí)別human CTLA-4的L3D10不能有效阻斷CTLA-4/B7的相互作用。盡管如此，在CTLA-4全人源化和半人源化的小鼠模型中，L3D10和Ipilimumab都能有效的消除MC38腫瘤【圖3A、圖3B】和減緩B16腫瘤的生長。

       2）將半人源化的L3D10進(jìn)行完全人源化后篩選得到的兩株失去阻斷CTLA-4/B7相互作用能力的HL12和HL32抗體【圖3C】，并沒有影響其抗腫瘤的作用，因?yàn)镠L12和HL32展現(xiàn)出與Ipilimumab一樣的抗腫瘤效果【圖3D】。

       3）用B7分子的阻斷性抗體1G10/GL1處理實(shí)驗(yàn)小鼠，在事先阻斷B7功能的情況下，Ipilimumab仍能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用，進(jìn)一步說明其并不依賴于阻斷抑制性的CTLA-4/B7信號(hào)通路【圖3E】。

       4）三種常見的抗mouse CTLA-4抗體（4F10/9D9/9H10），它們阻斷CTLA-4/B7相互作用的能力差別很大（如9D9和L3D10一樣具強(qiáng)阻斷能力，而9H10則不顯示或者具備非常弱的阻斷能力）。然而，文獻(xiàn)報(bào)道它們都具備非常好的抗腫瘤作用。

       圖3. 抗CTLA-4抗體治療腫瘤的主要分子機(jī)制是通過清除腫瘤局部的Treg，而不是通過阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號(hào)通路。（摘自Cell Research (2018) doi:10.1038/s41422-018-0011-0）

       深入研究表明，所有能有效抗腫瘤的抗CTLA-4抗體，包括強(qiáng)阻斷能力的L3D10和非常弱阻斷能力的Ipilimumab/HL12/HL32，都能夠有效的清除腫瘤局部的Treg【圖3F，圖3G】。而用Fc受體的阻斷抗體2.4G2同時(shí)處理小鼠來消除抗體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）和抗體介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP），則能顯著逆轉(zhuǎn)Ipilimumab的抗腫瘤效果【圖3H】。因此，劉陽/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室的研究表明，抗CTLA-4抗體發(fā)揮治療腫瘤功效的主要分子機(jī)制是通過清除腫瘤局部的Treg，而不是通過阻斷CTLA-4/B7相互作用的抑制性信號(hào)通路。這項(xiàng)研究有力地駁斥了當(dāng)前流行的在癌癥免疫治療中針對(duì)CTLA-4分子的免疫檢查點(diǎn)的理論假說。

       劉陽/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室在CTLA-4領(lǐng)域的另一個(gè)方面的研究，集中在建立和評(píng)估抗CTLA-4抗體在免疫治療誘導(dǎo)的副作用（irAE，immunotherapy related adverse events）的小鼠模型。Ipilimumab作為腫瘤免疫治療的杰出代表，具有非常好的抗黑色素瘤的作用，同時(shí)也有非常強(qiáng)的免疫治療誘導(dǎo)的副作用（N Engl J Med. 2015 Jul 2;373(1):23-34.）。臨床研究表明，針對(duì)多靶點(diǎn)的更有效的聯(lián)合用藥是免疫治療的臨床推進(jìn)方向，例如Ipilimumab和Nivolumab （抗PD-1的抗體）強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合后抗腫瘤效果大增。然而，一半以上的患者產(chǎn)生了3-4級(jí)嚴(yán)重的副作用，因此限制了抗CTLA-4抗體的研發(fā)與應(yīng)用（Lancet Oncol. 2017 Jan;18(1):31-41.和N Engl J Med. 2017 Nov 9;377(19):1824-1835.）。 目前，并沒有一個(gè)非常好的臨床前模型來評(píng)估抗CTLA-4抗體的免疫治療誘導(dǎo)的副作用。

       圖4. 利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型來模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯(lián)用造成的免疫副作用，并評(píng)估Ipilimumab和其它抗CTLA-4抗體的安全性。（摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z）

       研究發(fā)現(xiàn)， CTLA-4人源化的新生小鼠模型【圖4A】，可以用來有效地模擬臨床上Ipilimumab單用以及聯(lián)用造成的各個(gè)臟器的免疫副作用。這些副作用的表型和臨床發(fā)現(xiàn)的Ipilimumab單獨(dú)治療或聯(lián)合抗PD-1抗體治療后產(chǎn)生的副作用表型非常相似【圖4B】。比如，貧血，心肌炎，肺炎，肝炎，腎 臟等多器官炎癥。值得注意的是，半人源化抗體L3D10以及其完全人源化后的突變體抗體HL12和HL32在取得與Ipilimumab一樣的甚至強(qiáng)于Ipilimumab的抗腫瘤效果的情況下，并沒有產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用【圖4C】。同樣，利用human CTLA-4全人源化（CTLA4h/h ）和半人源化（CTLA4h/m）的新生小鼠模型，研究者發(fā)現(xiàn)，再現(xiàn)Ipilimumab的免疫副作用需要CTLA4雙等位基因的參與，因?yàn)樵诎肴嗽椿律∈竽Ｐ椭校?Ipilimumab并沒有顯示出強(qiáng)烈的副作用【圖4D】。

       此外，研究者還發(fā)現(xiàn)這種免疫治療誘導(dǎo)的副作用，和全身的T細(xì)胞激活相關(guān)，特別是自我反應(yīng)性T細(xì)胞中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）的比例起決定性的作用。這項(xiàng)研究表明，抗CTLA-4抗體的抗腫瘤效果和免疫治療副作用的產(chǎn)生并不一定是相伴相隨的，因?yàn)樗鼈兊姆肿訖C(jī)制是不一樣的（一個(gè)依賴于腫瘤局部Treg的刪除，一個(gè)依賴于自體反應(yīng)性T細(xì)胞的擴(kuò)增和全身T細(xì)胞的激活， 【圖5】）。

       圖5. 抗CTLA-4抗體在免疫治療誘導(dǎo)的副作用（irAE，immunotherapy related adverse events ）和 癌癥免疫治療效果（CITE，cancer immunotherapeutic effect）中有著截然不同的分子機(jī)制。 irAE是外周淋巴器官中自體反應(yīng)性T細(xì)胞的多克隆擴(kuò)增造成的，主要是通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成自身反應(yīng)性Treg細(xì)胞。 CITE引起的腫瘤排斥是通過FcR介導(dǎo)的特異性清除腫瘤微環(huán)境中的Treg細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，并且此過程獨(dú)立于外周淋巴器官中天然T細(xì)胞的活化。此外，irAE和CITE都不依賴于對(duì)CTLA-4/B7相互作用的阻斷。（摘自Cell Research (2018)doi:10.1038/s41422-018-0012-z）

       劉陽/鄭盼教授聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室的一系列突破性研究成果，進(jìn)一步闡明了抗CTLA-4抗體的抗腫瘤分子機(jī)制，提供了有效的評(píng)價(jià)抗CTLA-4抗體藥物安全性的小鼠模型，并初步篩選到相對(duì)于Ipilimumab更加安全的抗CTLA-4抗體克隆株HL12和HL32，這些研究對(duì)今后第3代抗CTLA-4抗體以及以CTLA-4為靶點(diǎn)的其它類型藥物的研發(fā)有著重要的指導(dǎo)意義。

       據(jù)悉，本研究完成于美國國立兒童醫(yī)學(xué)中心的癌癥與免疫學(xué)研究中心。杜雪相博士、唐飛博士和劉明月博士為兩篇論文的共同第一作者，劉陽教授和鄭盼教授為共同通訊作者。

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