三葉草生物：三聚體技術(shù)挑戰(zhàn)傳統(tǒng)抗體

       2017年12月14日，三葉草生物制藥宣布獲得由四川天和生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)業(yè)投資基金領(lǐng)投的6280萬人民幣的A輪融資，用于推進(jìn)大分子生物藥的開發(fā)。預(yù)計(jì)在2018年，公司將有兩個(gè)產(chǎn)品進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)。小編將從三葉草生物的核心技術(shù)和研發(fā)管線著手，對(duì)三葉草生物進(jìn)行解讀。

       三葉草生物概況

       三葉草生物由董事長梁朋博士2007年在成都創(chuàng)辦，致力于創(chuàng)新藥及高端生物類似藥的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化。梁朋博士本科畢業(yè)于北京大學(xué)生物系，80年代經(jīng)中美交換計(jì)劃CUSBEA赴美留學(xué)，是CUSBEA第二屆的學(xué)生。在哈佛大學(xué)做博士后期間，梁朋博士發(fā)明了“基因差異顯示技術(shù)”，并以此創(chuàng)辦了GenHunter公司。之后，基于自己開發(fā)的蛋白質(zhì)三聚體技術(shù)，梁朋博士2007年回成都創(chuàng)辦了四川三葉草生物制藥公司。目前，除了擔(dān)任三葉草生物的董事長之外，梁朋博士還是四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的教授。

       三葉草生物制藥公司規(guī)模雖然不大，但獲得了國家十二五重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)及國家863計(jì)劃重點(diǎn)支持。管理團(tuán)隊(duì)的陣容也堪稱豪華，共有五名中組部國家“千人計(jì)劃”入選者，除了梁朋博士本人之外，還有北京生命科學(xué)研究所所長及百濟(jì)神州董事長王曉東博士和天津杰科生物醫(yī)藥研限公司總裁朱建偉博士，以及兩名科學(xué)顧問張勁游博士和羅順博士。除了一流的科研團(tuán)隊(duì)，三葉草還擁有創(chuàng)新生物制藥研發(fā)平臺(tái)Trimer-Tag© ，和符合cGMP要求的生產(chǎn)車間。包括本輪融資，三葉草在2017年累計(jì)獲得了8430萬元人民幣的投資，相信可以加速公司手中大分子生物制藥產(chǎn)品，包括即將進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)的兩個(gè)產(chǎn)品的研發(fā)和推進(jìn)。

       核心技術(shù) Trimer-Tag©

       三葉草生物的核心技術(shù)在于其Trimer-Tag© （蛋白質(zhì)三聚體化）平臺(tái)。許多重要疾病的治療靶點(diǎn)及其相關(guān)信號(hào)通路的激活依賴于配體的三聚體化，如腫瘤壞死因子超家族（TNF gene superfamily）以及負(fù)責(zé)進(jìn)入宿主細(xì)胞的包膜RNA病毒抗原等。三葉草生物主要通過其核心的Trimer-Tag© 技術(shù)，將目的蛋白與分泌性全人膠原蛋白C端前肽（C-prodomain peptide）標(biāo)簽融合，通過該標(biāo)簽形成天然的二硫鍵共價(jià)交聯(lián)的同源三聚體蛋白，用以靶向那些天然需要三聚體配體來激活的疾病靶點(diǎn)。

       與傳統(tǒng)的單克隆抗體藥物或重組蛋白藥物相比，Trimer-Tag© 技術(shù)下的三聚體融合蛋白有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：

       1. 天然共價(jià)交聯(lián)的三聚體結(jié)構(gòu)更利于激活需要三聚體配體-受體結(jié)合的靶點(diǎn)。與之相比，單克隆抗體/Fc-融合蛋白為非天然的二聚體結(jié)構(gòu)，并不能有效地激活需要三聚體的信號(hào)通路，這也許是為什么之前許多TRAIL相關(guān)的抗體藥物在臨床測試中并沒有良好表現(xiàn)的原因之一。此外，一些天然人重組三聚體蛋白由于是非共價(jià)交聯(lián)的結(jié)構(gòu)，本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，也無法有效地激活下游信號(hào)通路。相比之下，Trimer-Tag© 構(gòu)建的天然共價(jià)交聯(lián)的三聚體融合蛋白更能穩(wěn)定有效地激活目標(biāo)靶點(diǎn)。

       2. 全人的蛋白氨基酸序列，**或免疫原的可能性較低。Trimer-Tag© 使用的標(biāo)簽為能夠自身以二硫鍵共價(jià)穩(wěn)固三聚化的膠原蛋白原C端前肽，主要來源于原纖型膠原蛋中的pro.α.1(I)、pro.α.2(I)、pro.α.1(II)、pro.α.1(III)、pro.α.1(V)、pro.α.2(V)、pro.α.1(XI)、pro.α.2(XI)和 pro.α.3(XI)。膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)，其中膠原蛋白的三聚C端前肽在血液中天然為亞微克/毫升水平，并且未知對(duì)身體有**。因此，使用膠原蛋白原C端前肽作為標(biāo)簽的三聚體融合蛋白可能的人體**或免疫原性較低，而不像此前使用非人源性亮氨酸拉鏈(leucine zipper)標(biāo)簽或His標(biāo)簽的三聚體蛋白一樣有較強(qiáng)的肝**。

       3. 保留可變區(qū)目的蛋白天然的氨基酸順序和功能。由于三聚體化是由通用的膠原蛋白C端前肽實(shí)現(xiàn)，因此不需要改變可變區(qū)蛋白的氨基酸序列，此外可變區(qū)的蛋白質(zhì)與膠原C-前肽間的距離可以通過膠原的線性三股螺旋區(qū)來精確調(diào)節(jié)，以實(shí)現(xiàn)其生物活性。這為Trimer-Tag© 的靈活應(yīng)用提供了可能性。

       4. 藥物動(dòng)力學(xué)優(yōu)化，通過修飾膠原蛋白C端前肽標(biāo)簽，延長融合蛋白的半衰期。之前天然人重組三聚體蛋白被發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中半衰期非常短，有可能是因?yàn)槠浞肿恿啃∏曳枪矁r(jià)交聯(lián)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定導(dǎo)致了被腎濾過清除。Trimer-Tag© 中使用的標(biāo)簽一方面增大了融合蛋白的分子量，另一方面通過共價(jià)交聯(lián)提高了蛋白的穩(wěn)定性，有助于其半衰期的延長。此外，在一些情況下，膠原蛋白C端前肽標(biāo)簽上的BMP-1蛋白酶識(shí)別序列發(fā)生了突變或缺失，進(jìn)一步有助于融合蛋白在體內(nèi)穩(wěn)定性的提高。

       目前，Trimer-Tag© 已有全球?qū)＠Ｗo(hù)（美國、歐洲、日本、中國），三葉草生物從梁朋博士在美國創(chuàng)辦的GenHunter公司獲得了用Trimer-Tag© 進(jìn)行藥物研發(fā)的獨(dú)家授權(quán)。

       從三葉草生物制藥的研發(fā)管線布局可以看到，三葉草生物應(yīng)用Trimer-Tag© 技術(shù)，重點(diǎn)發(fā)展領(lǐng)域?yàn)槟[瘤治療和自身免疫性疾病，此外，在重組**這一領(lǐng)域也在進(jìn)行前期研發(fā)和尋求合作機(jī)會(huì)。

       腫瘤治療

       目前，三葉草生物制藥臨床研究進(jìn)展最快的是重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)三聚體融合蛋白(SCB-313)，預(yù)計(jì)在2018年初在澳洲進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)，并計(jì)劃在2018年上半年完成國內(nèi)臨床申報(bào)。

       TRAIL, 也被稱為Apo2L，可以通過結(jié)合受體DR4或DR5（也被稱為TRAIL-R1及TRAIL-R2）而誘導(dǎo)受體三聚體化并特異性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

       △源自H. Belkahla et al. Nanoscale, 2017,9,5755

       由于其特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的特性，TRAIL的受體DR4和DR5很早就被視為有潛力抗癌藥物靶點(diǎn)并被寄予厚望。然而，此前不管是針對(duì)DR4的單克隆抗體藥物Mapatumumab (HGS-ETR1)，還是針對(duì)DR5的單克隆抗體藥物Conatumumab (AMG-655)，Lexatumumab (HGS-ETR2)，Tigatuzumab (CS-1008)，Drozitumab (PRO95780/ apomap) 及LBY-135，都因?yàn)闆]有明顯的抗腫瘤效果而紛紛止步于I期或II期臨床試驗(yàn)。由于DR4及DR5的激活需要受體的三聚體化，因此這些二聚體化的抗體藥物沒有明顯的臨床效果也在意料之中。然而，Amgen的可溶性重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體藥物Dulanermin (AMG-951/rhApo2L)盡管擁有天然的TRAIL三聚體結(jié)構(gòu)，也沒有在臨床試驗(yàn)中有很好的表現(xiàn)。這可能是因?yàn)镈ulanermin的分子量太小以及非共價(jià)交聯(lián)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導(dǎo)致其在人體內(nèi)半衰期太短而對(duì)腫瘤沒有療效。雖然可以通過人為地給TRAIL添加標(biāo)簽，如亮氨酸拉鏈標(biāo)簽（izTRAIL）及N端His標(biāo)簽（SuperKillerTRAIL）來穩(wěn)定TRAIL并延長其半衰期，然而融合了這些非人源性的標(biāo)簽的TRAIL都展現(xiàn)了較強(qiáng)的肝**，不適于進(jìn)一步人體試驗(yàn)。

       三葉草生物的SCB-313應(yīng)用Trimer-Tag© 技術(shù)將人源TRAIL與人源膠原蛋白α1(I)C端前肽融合形成了由二硫鍵共價(jià)交聯(lián)的分泌性三聚體蛋白，并在中華倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）中高表達(dá)產(chǎn)生。與二聚體TRAIL-Fc相比，SCB-313,也就是TRAIL-Trimer的體外生物活性和結(jié)合受體能力提高了4個(gè)數(shù)量級(jí)。另一方面，雖然TRAIL-Trimer與天然三聚體TRAIL相比體外生物活性相當(dāng)，但得益于Trimer-Tag© 的作用，其在老鼠體內(nèi)的半衰期是天然三聚體TRAIL的三倍，并在裸鼠移植瘤模型中體現(xiàn)了更好的腫瘤殺傷力。安全性方面，TRAIL-Trimer和天然三聚體TRAIL一樣表現(xiàn)出了低**，在人源肝細(xì)胞、裸鼠以及獼猴體內(nèi)都沒有表現(xiàn)出肝**。

       總而言之，SCB-313作為世界首例人源膠原蛋白重組三聚體化TRAIL靶向藥物，通過Trimer-Tag© 技術(shù)，既兼顧了天然TRAIL的低**，又克服了其不穩(wěn)定半衰期短的問題，與此同時(shí)，TRAIL-Trimer比之前二聚體結(jié)構(gòu)的TRAIL抗體生物活性既受體結(jié)合能力高出4個(gè)數(shù)量級(jí)，臨床效果值得期待。當(dāng)然，基于此前對(duì)TRAIL信號(hào)通路的研究，有許多種情況可能阻斷TRAIL誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，如腫瘤細(xì)胞過表達(dá)TRAIL-R3/R4、cFLIP、IAP、Bcl-2，或者缺失Bax及Bak等。因此TRAIL臨床上的有效性也要依賴于進(jìn)一步對(duì)TRAIL適用型腫瘤生物標(biāo)記的研究。

       除了TRAIL-Trimer，三葉草制藥在研的三聚體藥物還有靶向4-1BB的SCB-333(4-1BBL-Trimer)和靶向OX40的SCB-340(OX40L-Trimer)。這兩種藥物都是通過刺激T細(xì)胞活化和增殖來達(dá)到殺傷腫瘤的作用。這兩種藥物都是應(yīng)用Trimer-Tag© 技術(shù)來構(gòu)建的三聚體融合蛋白，目前還在較為早期的研發(fā)階段。

       自身免疫性疾病

       除創(chuàng)新型藥物外，三葉草生物研發(fā)管線中另一個(gè)重要領(lǐng)域是生物類似藥的研發(fā)。其中，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫性疾病的Enbrela(依那西普)生物類似藥SCB-808預(yù)充填小容量注射液已經(jīng)獲得CFDA的臨床批件，預(yù)計(jì)在2018年中期進(jìn)入中國I期臨床試驗(yàn)。依那西普是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他自身免疫性疾病患者的一線靶向用藥之一，2016年的全球銷售額超過600億人民幣。中國市場上的依那西普生物類似藥都是凍干粉制劑型，需要在醫(yī)務(wù)人員的協(xié)助下用注射用水進(jìn)行溶解后才能注射使用。SCB-808作為中國首例水針劑型依那西普注射液，一方面價(jià)格可能僅為原研藥的1/5，另一方面有可能讓患者或家屬在家自行注射使用，使用更為方便。

       此外，三葉草生物也在進(jìn)行針對(duì)化療引起的血小板減少癥（CIT）、特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP），以及老年黃斑變性（wAMD）進(jìn)行生物類似藥的早期研發(fā)，具體的產(chǎn)品信息尚未公開。

       重組**

       從三葉草研發(fā)管線布局看，三葉草生物也想利用Trimer-Tag© 技術(shù)開發(fā)針對(duì)有三聚體抗原的病毒的**，主要包括艾滋病（HIV-1），呼吸道合胞?。≧SV）和流感。到目前為止，已有一些初步的理論或數(shù)據(jù)表明三聚體抗原**可能更有效地刺激抗體的產(chǎn)生。三葉草生物正在尋找潛在的合作者共同開發(fā)三聚體**項(xiàng)目。

       總結(jié)

       三葉草生物是為數(shù)不多的擁有核心技術(shù)（Trimer-Tag© ）創(chuàng)新生物藥研發(fā)平臺(tái)及自身cGMP生產(chǎn)能力的生物制藥公司之一。其三聚體技術(shù)開發(fā)的腫瘤靶點(diǎn)藥物與傳統(tǒng)的抗體藥物和重組蛋白靶點(diǎn)藥物相比，理論上有更好的效果，目前即將在澳洲進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。如果此次臨床獲得較好的結(jié)果，可以想象三葉草制藥作為一家走在三聚體靶點(diǎn)藥物開發(fā)最前沿的創(chuàng)新型公司，將吸引更多投資者的目光。