基因編輯 2.0：經(jīng)典CRISPR系統(tǒng)已不夠用了

       據(jù)國外媒體報(bào)道，在不到 5 年時(shí)間里，基因編輯技術(shù) CRISPR 已經(jīng)使現(xiàn)代生物學(xué)的面貌和發(fā)展節(jié)奏發(fā)生了革命性改變。這種技術(shù)在能夠發(fā)現(xiàn)、去除并取代遺傳物質(zhì)，自 2012 年首次報(bào)道至今，科學(xué)家已經(jīng)發(fā)表了超過 5000 篇涉及該技術(shù)的論文。生物化學(xué)研究者擁抱這項(xiàng)技術(shù)，希望用其創(chuàng)造出更好的疾病模型。無數(shù)公司已經(jīng)將這項(xiàng)技術(shù)投入到新型藥物、療法、食品、化合物和新材料的研發(fā)之中，試圖獲取新的商業(yè)利益。

       通常情況下，當(dāng)我們提到 CRISPR 時(shí)，實(shí)際指的是 CRISPR/Cas 系統(tǒng)——由一小段 RNA 和一種高效的 DNA 切割酶（即核酸酶）組成，全名為常間回文重復(fù)序列叢集 / 常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins）。它對于生物學(xué)的意義，就好比福特 T 型車對于制造業(yè)和交通運(yùn)輸業(yè)的意義?，F(xiàn)在，CRISPR 已經(jīng)用于人類癌癥的治療，而最快到 2018 年時(shí)，該技術(shù)還將用在遺傳性疾病，如鐮刀型紅血球疾病和乙型地中海貧血癥等的臨床試驗(yàn)中。

       然而，與當(dāng)初的福特 T 型車一樣，經(jīng)典的 CRISPR 技術(shù)已經(jīng)變得有點(diǎn)粗苯、不可靠，甚至有點(diǎn)危險(xiǎn)。它無法與基因組的任意部位結(jié)合，有時(shí)候還會(huì)切割錯(cuò)誤的位置。而且，它沒有關(guān)閉按鈕。如果說福特 T 型車很容易過熱，那經(jīng)典 CRISPR 可以說是很容易“吃多”。

       即使有著這樣那樣的局限性，但經(jīng)典 CRISPR 系統(tǒng)在 2018 年及以后的日子里，依然將是生物學(xué)中非常重要的工具。不過，就在 2017 年，更新、更快的基因編輯工具開始推出，或許很快就會(huì)讓第一代技術(shù)黯然失色。因此，如果你有志于在這一領(lǐng)域大展身手的話，請做好準(zhǔn)備，因?yàn)?ldquo;基因編輯 2.0”就在眼前！

       突飛猛進(jìn)

       有針對性的切割操作是 CRISPR 技術(shù)的標(biāo)志性特征。但是，在 Cas9 內(nèi)切核酸酶切割一個(gè)生物體的兩股 DNA 鏈的同時(shí)，也會(huì)帶來某種風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞在修復(fù)這種劇烈的基因損傷時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。這也是科學(xué)家希望設(shè)計(jì)出更安全的方法，以達(dá)到同樣目的的原因。

       一種方法是使 Cas9 核酸酶突變，使其失去切割能力，但依然能結(jié)合 DNA。接著，用其他蛋白質(zhì)——比如能激活基因表達(dá)的蛋白質(zhì)——與失去部分功能的 Cas9 核酸酶結(jié)合，在不改變 DNA 序列的情況下共同控制基因的開啟和關(guān)閉（有時(shí)要用到光或化學(xué)信號）。這種“表觀遺傳學(xué)編輯”或許能用于治療由多種遺傳因素共同引起的疾病，而經(jīng)典 CRISPR 技術(shù)最適合的則是由單一突變導(dǎo)致的功能障礙問題。12 月初，美國索爾克研究所的研究人員就在小鼠上嘗試了這種新的方法，對包括糖尿病、急性腎病和肌肉營養(yǎng)不良癥等嚴(yán)重疾病進(jìn)行治療。

       哈佛大學(xué)和布羅德研究所的科學(xué)家甚至已經(jīng)對 CRISPR 系統(tǒng)進(jìn)行了更大膽的改進(jìn)：對單個(gè)堿基對進(jìn)行編輯。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，他們必須設(shè)計(jì)出一種全新的、在自然界中不存在的酶，能夠從化學(xué)上將配對的腺嘌呤（A）- 胸腺嘧啶（T）轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤（G）- 胞嘧啶（C）。這一改變看似微小，卻有著極為重大的意義。哈佛大學(xué)化學(xué)家戴維·劉（David Liu）主持了這項(xiàng)工作，他估計(jì)，在人體已知 32000 個(gè)致病性的點(diǎn)突變中，有大約一半可以通過這樣的單一位點(diǎn)變換而修復(fù)。“我不希望公眾對此有錯(cuò)誤的理解，即我們能把任何人或任何動(dòng)物，甚至培養(yǎng)皿里的細(xì)胞的任意 DNA 片段變換成另一段 DNA，”戴維·劉說，“不過，就我們現(xiàn)在所處的位置而言，也意味著很多責(zé)任。的問題在于，這個(gè)時(shí)代能達(dá)到的能力有多大？以及我們?nèi)绾文鼙M可能快地用這些技術(shù)來造福社會(huì)？”

       如何控制風(fēng)險(xiǎn)？

       CRISPR/Cas 系統(tǒng)是存在于多數(shù)細(xì)菌和絕大多數(shù)古菌中的一種后天免疫機(jī)制，其工作就是發(fā)現(xiàn)入侵的病毒 DNA 并將其消滅，直到這些 DNA 被清除干凈。這一系統(tǒng)都是“加速器”，沒有制動(dòng)裝置，因而具有潛在的危險(xiǎn)性——尤其是在臨床應(yīng)用上。CRISPR 在細(xì)胞里存留的時(shí)間越長，它把某些片段當(dāng)作目標(biāo)基因并進(jìn)行切割的風(fēng)險(xiǎn)就越大。

       為了程度地降低這些偏離目標(biāo)的問題，科學(xué)家一直在開發(fā)新的工具，以更好地控制 CRISPR。截至目前，研究者已經(jīng)識別出 21 個(gè)自然出現(xiàn)的抗 CRISPR（anti-CRISPR）蛋白質(zhì)家族，即能夠抑制基因編輯酶的蛋白質(zhì)分子。不過，科學(xué)家只了解其中少數(shù)幾種蛋白質(zhì)的工作機(jī)制。有些蛋白質(zhì)能直接與 Cas9 結(jié)合，阻止它連接到 DNA 上；另一些蛋白質(zhì)則可以激活與 Cas9 競爭基因組位置的酶。目前，加州大學(xué)伯克利分校、加州大學(xué)舊金山分校、哈佛大學(xué)、布羅德研究所和多倫多大學(xué)都在努力研究利用這些天然關(guān)閉機(jī)制的方法，使它們成為可編碼的控制工具。

       除了醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，這些蛋白質(zhì)家族還對“基因驅(qū)動(dòng)”（gene drive）領(lǐng)域的持續(xù)發(fā)展有重要意義。基因驅(qū)動(dòng)最早在 2003 年由倫敦帝國理工學(xué)院演化遺傳學(xué)家奧斯汀·伯特（Austin Burt）提出，指一種能將特定性狀快速擴(kuò)散到種群中的基因編輯技術(shù)。如果能以某種方式推動(dòng)演化進(jìn)程，將非常有利于人類應(yīng)對從流行性疾病到氣候變化等諸多問題。比如，我們可以用這種方法消滅那些導(dǎo)致瘧疾的蚊子，或者清除有害的入侵物種。不過，在野外環(huán)境中，這些手段也有可能失去控制，甚至帶來災(zāi)難性的后果。就在 2017 年，美國國防部下屬的國防高級研究計(jì)劃（DARPA）就投資了 6500 萬美元，用于尋找更加安全的基因驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)，其中就包括抗 CRISPR“關(guān)閉開關(guān)”。

       Cas酶的進(jìn)展

       盡管幾十年來基因技術(shù)突飛猛進(jìn)，但還是有很多科學(xué)家不理解為什么 DNA 中的某些缺陷會(huì)引發(fā)疾病。即使我們知道哪些基因以什么順序編碼進(jìn)入細(xì)胞，但想知道這些序列信息如何傳遞、如何翻譯（或者不翻譯），就要困難得多。這也正是哈佛大學(xué)和布羅德研究所的張鋒（CRISPR 關(guān)聯(lián)蛋白的發(fā)現(xiàn)者之一）團(tuán)隊(duì)尋找以 RNA 為目標(biāo)的 Cas 酶的原因。

       由于細(xì)胞在組裝蛋白質(zhì)時(shí)讀取的遺傳信息來自 RNA，因此它們攜帶著更多關(guān)于特殊疾病的基礎(chǔ)遺傳信息。而且，由于 RNA 不斷被轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此對 RNA 的修改有助于更好地治療類似發(fā)炎或創(chuàng)傷等短期疾病。這一新系統(tǒng)被稱為“REPAIR”，全稱是“可編程的腺嘌呤到肌苷 RNA 編輯”（RNA Editing for Programmable A to I Replacement），目前只能對單個(gè)核苷酸進(jìn)行編輯。下一步，研究人員希望在其他 11 種可能的組合中嘗試這一技術(shù)。

       科學(xué)家其實(shí)一直在發(fā)現(xiàn)新的 Cas 酶。布羅德研究所的團(tuán)隊(duì)對核酸酶 Cpf1 的特征進(jìn)行了研究。這種酶與其他 Cas 酶具有幾個(gè)關(guān)鍵差異，包括在切割 DNA 時(shí)會(huì)留下較活躍的末端，而不是“鈍”的末端。2017 年 2 月，加州大學(xué)伯克利分校的研究小組發(fā)現(xiàn)了 CasY 和 CasX，這是目前最簡潔的 CRISPR 系統(tǒng)。未來幾個(gè)月或幾年里，科學(xué)家希望找到更多的酶，發(fā)現(xiàn)更多的可能性。

       只有時(shí)間才能證明 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是不是的基因編輯工具，抑或只是一場科學(xué)變革的開端。對于不同的應(yīng)用領(lǐng)域，科學(xué)家還需要大量的研究才能確定什么工具才最合適，目前能做的，或許只有同時(shí)推進(jìn)所有這些系統(tǒng)的研究。要想把基因編輯技術(shù)應(yīng)用到人類疾病治療、農(nóng)作物培育以及攜病昆蟲的防治上，可能還需要許多年的時(shí)間。